S. aureus là căn nguyên hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus có thể thành dịch với quy mô lớn. Độc tố ruột là yếu tố quyết định trong bệnh sinh của ngộ độc thực phẩm do S. aureus. Các độc tố này đều do các gen qui định gọi là các gen mã hóa độc tố ruột. Hiện nay, hơn 20 gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus đã đƣợc xác định. Theo Yukiko Hara-Kudo và Takahashi-Omoe, các độc tố ruột của S.
aureus (Staphylococcal enterotoxin, kí hiệu SE) đƣợc chia thành hai nhóm: nhóm độc tố ruột cổ điển và nhóm độc tố ruột mới. Nhóm cổ điển bao gồm: SEA, SEB, SEC, SED và SEE. Nhóm mới độc tố ruột mới gồm: SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SEO, SEP, SEQ, SER, SEU và SEV [101]. Để xác định ngộ độc thực phẩm do S. aureus chúng ta căn cứ vào những tiêu chuẩn nhƣ: có trên 105
vi khuẩn/g thức ăn, có cùng chung chủng
S. aureus hoặc SE ở cả hai mẫu thức ăn và bệnh nhân, trong trƣờng hợp SE bị phá hủy không hoạt động thì xác định gen se của vi khuẩn ở mẫu thức ăn. Vì vậy những nghiên cứu sinh học phân tử, xác định các gen độc tố đóng vai trò vô cùng quan trọng trong nghiên cứu và xác định căn nguyên, nguồn gốc các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus [61]. Những ngƣời mang vi khuẩn là nguồn dự trữ vi khuẩn. Trong những điều kiện nhất định có thể trở thành nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm. Đặc biệt ở Việt Nam khí hậu nóng ẩm, điều kiện bảo quản thực phẩm còn hạn chế, thiếu tủ lạnh để bảo quản thức ăn. Chỉ cần một lƣợng nhỏ vài vi khuẩn, sau 5 giờ số lƣợng vi khuẩn đƣợc nhân lên 102
-104 lần [38] (số lƣợng S. aureus đƣợc phép có trong thức ăn chƣa qua nhiệt là 102/g và thức ăn đã qua nhiệt là 10/g thức ăn [1]).
Kỹ thuật sinh học phân tử PCR đƣợc ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu y sinh học nói chung và xác định gen độc lực nói riêng. Đây là kỹ thuật đƣợc sử dụng để xác định gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus với nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣ độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian cho kết quả nhanh. Kỹ thuật PCR xác định chính xác S. aureus mang loại gen mã hóa độc tố ruột. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán căn nguyên, nghiên cứu sâu hơn về cơ chế bệnh sinh và dịch tễ học phân tử của S. aureus.
4.2.2.1. Tỷ lệ mang các gen mã hóa độc tố ruột
Trong nghiên cứu này, 64/101 chủng S. aureus đƣợc phân lập từ tay và mũi của nhân viên phục vụ và nấu ăn trong các nhà hàng tại Hà Nội mang
ít nhất một gen mã hóa cho độc tố ruột. Tỷ lệ mang gen mã hóa độc tố ruột là 63,37%. Theo nghiên cứu của Kerouanton A. năm 2006 tại Pháp 100%, S. aureus phân lập đƣợc từ các vụ dịch ngộ độc thức phẩm có mang gen độc tố ruột se, trong đó 87,9% mang 1 gen se. Trong nghiên cứu này tác giả cũng ứng dụng kỹ thuật PCR đơn mồi cho từng gen độc tố ruột riêng nhƣ trong nghiên cứu của chúng tôi [72]. Một nghiên cứu khác của Vazquez - Sanchez ở Tây Ban Nha năm 2012 trên 114 chủng S. aureus phát hiện có tới 91% số chủng mang gen se [120]. Al Bustan M.A và cộng sự nghiên cứu trên các chủng S. aureus đƣợc phân lập từ 500 nhân viên nhà hàng cho thấy có tới 86,6% các chủng có sinh độc tố ruột [30].
So sánh kết quả của chúng tôi với những nghiên cứu khác trên thế giới, kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn kết quả nghiên cứu của Edet E. Udo năm 2009 trên 200 nhân viên nhà hàng tại Kuwait (71%). Nghiên cứu này sử dụng 3 cặp đa mồi multiplex (MT): MT1 cho sec, sed, sei; MT2 cho
seg, seh, see; MT3 cho sea, seb, tst [42]. Trong nghiên cứu của chúng tôi sử dụng PCR đơn mồi cho mỗi gen se. Tỷ lệ của chúng tôi cũng thấp hơn so với nghiên cứu của Srinivasan V năm 2006 tại Mỹ (93,6%) [112], của Sauer và cộng sự (89%) [106], Maslankova và cộng sự (75%) [84], Yu-Cheng Chiang và cộng sự (71,4%) [128]. Nghiên cứu của chúng tôi có kết quả về tỷ lệ các gen mã hóa độc tố ruột gần tƣơng đƣơng với các nghiên cứu của Rall và cộng sự (68,4%). Trong nghiên cứu của mình, Rall cũng ứng dụng kỹ thuật PCR đơn mồi cho mỗi cặp mồi gen độc tố ruột giống nhƣ của chúng tôi [103]. Kết quả của chúng tôi gần tƣơng tự nhƣ của Marcia Regina Pelisser và cộng sự năm 2009 là 67% [81], của Mark M. Collery năm 2007 (66,7%) [82].
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cao hơn so với nghiên cứu của Hazariwala Amita (51%) [55], Murat-Karahan tại Thổ Nhĩ Kỳ năm 2009 là 29,3% [87]. Một nghiên cứu khác của Fueyo tại Tây Ban Nha năm 2001
cũng sử dụng cặp mồi riêng cho từng gen độc tố ruột cho thấy chỉ có 28% số chủng chứa một trong các gen se. Đây là nghiên cứu trên cả 110 chủng phân lập từ ngƣời mang S. aureus và 114 chủng S. aureus phân lập đƣợc từ thức ăn [45]. Các nghiên cứu này ứng dụng kỹ thuật PCR khác nhau về thiết kế mồi nhƣ đơn mồi, đa mồi hoặc PCR với mỗi nhóm 3 mồi khác nhau của gen độc tố ruột. Những kết quả này cho chúng ta thấy sự đa dạng của các nghiên cứu về tỷ lệ các gen mang độc tố ruột trên những đối tƣợng khác nhau và ở các vùng địa lý khác nhau.
4.2.2.2. Phân bố các gen mã hóa độc tố ruột
Ở bảng 4.3, kết quả nghiên cứu phân bố các gen mã hóa độc tố ruột của chúng tôi so với nghiên cứu trên cùng đối tƣợng nhân viên nhà ăn của Edet E. Udo năm 2009 ở 200 nhân viên nhà hàng tại Kuwait cho thấy tỷ lệ mang gen độc tố ruột tƣơng đƣơng nhau đối với các gen sea, seb, sec, sed, seg và khác nhau đối với các gen see (15,45% và 1,5%), sei (13,64% và 38,5%) [42].
Biểu đồ 3.6 cho thấy, trong số các gen mã hóa cho độc tố ruột thuộc nhóm cổ điển, gen sec xuất hiện nhiều nhất ở 24 chủng S. aureus (21,82%). So sánh kết quả của chúng tôi trong bảng 4.2 nhận thấy kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu khác cho thấy tỷ lệ mang gen sec 20,5% [103], 22% [55], 24,1% [84], cao hơn so với nghiên cứu của Manisha 7,5% [80], Yu Cheng Chiang năm 2006 8,2% [128] và năm 2008 6,8% [127], của Sauer 0,4% [106].
Gen sea 13,64% có tỷ lệ cao hơn so với nghiên cứu của Maslankova 5,1% [84], gần tƣơng tƣơng so với nghiên cứu của Mark Colley và 12,2% [82] và Sauer 12,1% [106], thấp hơn so với nghiên cứu của các tác giả khác từ 19% - 41% nhƣ Manisha 19,6%[80], Rall 41%[103], Sauer 12,1% [106], Yu Cheng 26,8% [127].
Tỷ lệ phân bố của gen seb là 11,82% cao hơn so với nhiều nghiên cứu khác từ 1,3% - 8%, thấp hơn so với nghiên cứu của Maslankova 19,3% [84],
Yu Cheng Chiang 19,7% [127] và 20,4% [128].
Bảng 4.3: Kết quả nghiên cứu gen độc tố ruột ở S. aureus của một số tác giả
Nghiên cứu sea
% seb % sec % sed % see % seg % sei % sej % Chúng tôi 13,64 11,82 21,82 2,73 15,45 20,91 13,64 0 E. E. Udo [42] 11 12,5 23 1,5 1,5 24 38,5 Manisha [80] 19,6 5,6 7,5 1,9 Maslankova J. [84] 5,1 19,3 24,1 10,1 Mark Colley [55] 12,2 2,4 22 24,4 Rall [103] 41 7,7 20,5 12,8 5,1 28,2 25,5 7,7 Yu Cheng C. [128] 28,6 20,4 8,2 2,0 30 Srinivasan [112] 1,3 52,6 24,4 60,3 Yu Cheng C. [127] 29,2 19,7 6,8 2,0 29,9 Sauer [106] 12,1 8,0 0,4 15,5 79,3 79,3 15,5 NĐ Phúc [20] 53,8 26,8 12,2 4,8 DT Tài [21] 4 3,19
Gen sed trong nghiên cứu này chiếm 2,73%. Tỷ lệ này gần tƣơng đƣơng nhƣ trong nghiên cứu của một số tác giả Manisha 1,9% [80], Yu Cheng Chiang 2% [127], [128], thấp hơn so với các nghiên cứu khác 10-52% nhƣ của Mark Colley 24,4% [55], Manisha 1,9% [80], Rall 12,8% [103], Srinivasan 52,6% [112]. Tỷ lệ gen see trong nghiên cứu của chúng tôi là 15,45% cao hơn so với nghiên cứu của Rall 5,1% [103].
nhất (23 chủng; 20,91%), tiếp theo là sei (15 chủng; 13,64%). Tỷ lệ gen seg
trong nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với các nghiên cứu của Rall 28,2% [103] và Srinivasan 24,4% [112] và thấp hơn nhiều so với nghiên cứu của Sauer 79,3% [106].
Tỷ lệ gen sei trong nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với các nghiên cứu khác nhƣ cảu Rall 25,5% [103], Yu Cheng Chiang 29,9% [127] và 30% [128] và thấp hơn nhiều so với nghiên cứu của Srinivasan 60,3% [112] và của Sauer 79,3% [106]. Trong nghiên cứu của chúng tôi không phát hiện đƣợc chủng mang gen sej. Trong các nghiên cứu khác nhƣ của Rall tỷ lệ gen sej 7,7% [103], và Sauer 15,5% [106].
Các nghiên cứu về gen độc tố ruột của S. aureus ở Việt Nam còn ít. Chúng tôi so sánh kết quả nghiên cứu này với nghiên cứu của 2 tác giả là Nguyễn Đỗ Phúc và Diệp Thế Tài, tuy nhiên chƣa có nghiên cứu trên đối tƣợng nhân viên nhà ăn mà là nghiên cứu trên mẫu thực phẩm và cũng trên gen độc tố ruột cổ điển nhƣ sea, seb, sec, sed, see. Trong bảng 4.3, tỷ lệ gen
sea, seb trong nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn của Nguyễn Đỗ Phúc (53,8% và 26,8%) [20] và cao hơn của Diệp thế Tài (4% và 3,19%) [21]. Tỷ lệ gen sec, see của chúng tôi cao hơn nghiên cứu của Nguyễn Đỗ Phúc (12,2% và 4,8%) [20].
Kết quả này cho thấy các gen mã hóa độc tố ruột của tụ cầu vàng ở Việt Nam rất đa dạng, không chỉ có các độc tố ruột thuộc nhóm cổ điển mà còn có cả các độc tố ruột mới. Trong nghiên cứu của chúng tôi gen sec và
seg chiếm ƣu thế khoảng gần 50%, kết quả này khác một số nghiên cứu ở nƣớc ngoài cho rằng gen sea và seb là những gen sinh độc tố ruột chiếm ƣu thế trên 50% và mã hóa cho độc tố ruột SEA và SEB, căn nguyên của 80- 90% các vụ dịch ngộ độc thực phẩm [101].
chiếm 2/3 tổng số các gen nghiên cứu. Kết quả này cũng phù hợp một số các nghiên cứu khác trên thế giới. Điều này có thể giải thích là những gen mã hóa độc tố ruột mới còn chƣa nghiên cứu nhiều thậm chí có thể còn nhiều gen mới sẽ tiếp tục đƣợc phát hiện. Sự khác biệt về tỷ lệ phân bố cũng cho thấy tính đa dạng về tỷ lệ các gen độc tố ruột ở những đối tƣợng và ở những vùng địa lý khác nhau [43].
Sự thay đổi về tỷ lệ các gen độc tố ruột chiếm ƣu thế cũng cho thấy vai trò của các gen độc tố ruột mới trong các nghiên cứu gần đây, ảnh hƣởng của chúng đối với ngộ độc thực phẩm. Kết quả này cũng cho chúng ta thấy sự thay đổi quan niệm về các gen độc tố ruột cổ điển mà trong một thời gian dài chúng đƣợc cho là nguyên nhân chính của các vụ ngộ độc thực phẩm.
4.2.2.3. Phân bố tỷ lệ các chủng S. aureus theo số lượng các gen mã hóa độc tố ruột.
Theo biểu đồ 3.7, có 30/64 chủng (46,88%) số chủng mang một gen mã hóa cho độc tố ruột, 37,5% (24/64) mang hai gen mã hóa cho độc tố ruột, 10,94% (7/64) mang ba gen, 4,69% (3/64) mang bốn gen.
Bảng 4.4: Sự phân bố tỷ lệ các chủng S. aureus theo số lượng các gen mã hóa độc tố ruột của một số nghiên cứu.
Mang 1 gen (%) Mang 2 gen (%) Mang 3 gen (%) Mang 4 gen (%) Số lƣợng chủng Chúng tôi 46,88 37,5 10,94 4,69 101 Rall. (2008) [103] 64,1 23,1 5,1 7,7 57 E.E.Udo (2009) [42] 35,21 38,03 19,72 7,04 142 Zschock (2005) [131] 21,31 45,9 19,67 13,11 61
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ chủng mang 1 gen mã hóa độc tố ruột (46,88%) cao hơn tỷ lệ chủng mang 2 gen (37,5%). Ở bảng 4.4, kết quả nghiên cứu của chúng tôi tƣơng tự với kết quả nghiên cứu của Rall và cộng sự (2008) trên 57 chủng S. aureus. Tỷ lệ chủng mang 1 gen mã hóa độc tố ruột chiếm tỷ lệ cao hơn, 64,1% mang một gen, 23,1% mang hai gen, 5,1% mang ba gen và 7,7% mang bốn gen [103].
Một số những nghiên cứu khác nhƣ của Edet E. Udo năm 2009 trên 142 chủng phân lập đƣợc từ 200 nhân viên tiếp xúc với thức ăn làm việc ở các nhà hàng khác nhau tại Kuwait cho thấy, tỷ lệ vi khuẩn mang gen 2 gen độc tố ruột (38,03%) cao hơn tỷ lệ mang 1 gen mã hóa độc tố ruột (35,21%) [42]. Nghiên cứu của Zschock cũng cho thấy, tỷ lệ chủng mang 2 loại gen cao hơn (45,9%) những chủng mang 1 gen (21,31%) [131]. Về phƣơng pháp và kỹ thuật nghiên cứu, Rall ứng dụng PCR đơn mồi tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu của chúng tôi cho mỗi gen độc tố ruột sea, seb, sec, sed, see, seg, sei, sej
[103]. Còn Edet E. Udo ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi cho mỗi 3 cặp mồi multiplex (MT): MT1 cho sec, sed, sei; MT2 cho seg, seh, see; MT3 cho sea, seb, tst. Trong nghiên cứu của Zschock, các gen độc tố ruột đƣợc xác định bằng kỹ thuật PCR đa mồi. Tuy nhiên cần có nhiều những nghiên cứu với số lƣợng chủng lớn hơn, trên những đối tƣợng và địa điểm khác nhau để có kết quả nghiên cứu đầy đủ, đa dạng và có nhiều ý nghĩa hơn.
KẾT LUẬN
1. Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú của S. aureus
Tỷ lệ mang S. aureus ở nhân viên làm việc tại một số cơ sở dịch vụ ăn uống tại Hà Nội là 25% (tính chung cả thƣờng xuyên và không thƣờng xuyên ở mũi và/ hoặc tay, n=212). Tỷ lệ mang S. aureus (cả thƣờng xuyên và không thƣờng xuyên) ở mũi là 21,7% và ở tay là 8,96%. Tỷ lệ mang thƣờng xuyên rất thấp, không có trƣờng hợp nào ở tay và chỉ có 1,42% ở mũi.
Tỷ lệ mang S. aureus không thƣờng xuyên ở mũi nữ cao hơn ở nam (29% và 12,5%), tỷ lệ mang thƣờng xuyên ở mũi nam cao hơn nữ (1,79% và 1%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05. Tỷ lệ mang khác nhau theo vị trí làm việc (bộ phận phục vụ bàn cao nhất, thứ hai là bộ phận rửa, tiếp theo là bộ phận phân phát và thấp nhất ở bộ phận chế biến). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05.
2. Các gen mã hóa coagulase và độc tố ruột của S. aureus
Đã xác định đƣợc 20 genotype gen mã hóa coagulase, genotype 6 chiếm ƣu thế (53,47%) từ 101 chủng S. aureus.
Tỷ lệ ngƣời mang S. aureus có 1 loại genotype coagulase là 73,58%; có 2 loại genotype là 24,53%; có 3 loại genotype là 1,89%.
Tỷ lệ S. aureus mang gen mã hóa độc tố ruột cổ điển sec (21,82%),
see (15,45%,) sea (13,64%), seb (11,82%) và sed (2,73%). Tỷ lệ mang gen mã hóa độc tố ruột mới seg (20,91%), sei (13,64%), không có chủng mang gen sej.
Số chủng S. aureus mang gen mã hóa độc tố ruột chiếm 63,37%, trong đó số chủng mang 1, 2, 3, 4 loại gen chiếm lần lƣợt là 46,88%, 37,5%, 10,94% và 4,69%.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Nghiên cứu đầu tiên về kiểu cách cƣ trú của S. aureus trên ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh ở Việt Nam.
2. Cung cấp thông tin khoa học về tình hình mang S. aureus ở nhóm ngƣời làm việc tại một số cơ sở dịch vụ ăn uống ở Hà Nội.
3. Nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về gen mã hóa coagulase và gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus phân lập đƣợc từ nhân viên làm việc ở cơ sở dịch vụ ăn uống.
4. Đóng góp vào kết quả nghiên cứu dịch tễ học phân tử gen mã hóa coagulase và gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus.
ĐỀ XUẤT
1. Các nhân viên tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm tại các cơ sở dịch vụ ăn uống cần đƣợc xét nghiệm S. aureus. Những ngƣời thƣờng xuyên mang S. aureus nên chuyển sang công việc không tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm.
2. Mở rộng nghiên cứu về các gen mã hóa coagulase và độc tố ruột của
S. aureus để xác định dịch tễ học phân tử của 2 loại gen này ở Việt Nam.
CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA NGHIÊN CỨU SINH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Lê Khánh Trâm, Đinh Hữu Dung, Nguyễn Vũ Trung (2011), Tỷ lệ
mang và đặc điểm cƣ trú của Staphylococcus aureus, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 77(6), tr. 29-33.
2. Lê Khánh Trâm, Đinh Hữu Dung, Phạm Thị Thùy Dƣơng, Nguyễn Vũ Trung (2012), Phân bố các gen mã hóa coagulase ở các genotype của
Staphylococcus aureus, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 78(1), tr. 1-5.