Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng đƣợc ứng dụng nhiều trong chẩn đoán và nghiên cứu S. aureus. Kết quả xác định sẽ nhanh hơn, nhiều trƣờng hợp đỡ tốn kém hơn. Đặc biệt, các kỹ thuật này cho các kết quả có độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao. Ngoài việc xác định nhanh căn nguyên vi
khuẩn với độ chính xác cao, các kỹ thuật sinh học phân tử còn có thể cho biết một số cơ chế gây bệnh của S. aureus. Ví dụ, trong trƣờng hợp xác định độc tố ruột của S. aureus. Việc xác định S. aureus và sự có mặt của một hoặc một số độc tố ruột có thể đƣợc phát hiện cùng một lúc bằng kỹ thuật PCR. PCR cũng cho phép xác định sự có mặt của gen liên quan đến sự kháng thuốc của S. aureus ví dụ nhƣ gen mecA, vanA [52]. Áp dụng kỹ thuật PCR để xác định và nghiên cứu các gen độc lực của S. aureus nhƣ
agr, tsst-1 gây hội chứng shock nhiễm độc. Ngoài ra, sử dụng một số cặp mồi đặc hiệu có khả năng khuếch đại một vùng gen đặc trƣng của vi khuẩn có thể xác định vi khuẩn này trong một loại bệnh phẩm nào đó. Ngày nay kỹ thuật PFGE và MLST đƣợc ứng dụng để xác định nguồn gốc của S. aureus trong các vụ dịch và phân typ chúng. Trong một số trƣờng hợp, bằng việc giải trình tự một đoạn nucleotide, sau đó so sánh trình tự này với các trình tự sẵn có trên ngân hàng gen, ngƣời ta có thể biết rằng đoạn nucleotide đó là của S. aureus [98].
1.7.2.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Năm 1985, nhà khoa học ngƣời Mỹ, Kary B. Mullis đã phát triển “phản ứng chuỗi trùng hợp‟‟ gọi là Polymerase Chain Reaction.
- Nguyên lý của phản ứng PCR: Dựa theo sự sao chép theo cơ chế
bán bảo tồn của DNA trong tế bào. Một đoạn của phân tử DNA chuỗi kép đƣợc tách ra làm hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi DNA mới. Kỹ thuật PCR đƣợc thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu, mồi này có khả năng bắt cặp, bổ sung vào hai đầu của hai sợi DNA khuôn theo chiều 5‟ đến 3‟ dƣới tác dụng của enzym Taq DNA polymerase. Mạch DNA mới đƣợc hình thành với các nucleotide bổ sung với các nuclotide trên sợi DNA khuôn. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, số lƣợng đoạn DNA cần tổng hợp sẽ tăng gấp đôi [27].
Kỹ thuật PCR ứng dụng trong xác định S. aureus
David P. Kateele và cộng sự ứng dụng kỹ thuật PCR nhân gen nuc của
S. aureus đƣợc sử dụng nhƣ kỹ thuật cơ bản, là tiêu chuẩn vàng để xác định
S. aureus [41]. Gonzalez V. và cộng sự ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử với mồi tác động đích 16S rRNA của S. aureus. Độ nhạy đạt đến 100%, độ đặc hiệu 99,4% [51]. Paola Cremonesi ứng dụng PCR đa mồi để xác định các gen cog, nuc, sea, seb, sec, sed, see, seg, she, sei, sej, sel. Kỹ thuật PCR đa mồi này có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn nhiều so với kỹ thuật ELISA [40]. Yu-cheng Chiang và cộng sự ứng dụng kỹ thuật PCR nghiên cứu gen độc tố tsst-1 ở Đài Loan [127]. Kỹ thuật PCR cũng đƣợc ứng dụng để xác định gen kháng kháng sinh nhƣ mecA, van A [100].
1.7.2.2. Kỹ thuật realtime PCR
- Nguyên lý: Là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR có khả năng vừa phát hiện vừa định lƣợng sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng (realtime nghĩa là đúng thời điểm).
Đây là kỹ thuật phát hiện không đồng nhất, một hỗn hợp của sản phẩm PCR đƣợc phát hiện mà không phải từng thành phần đƣợc phát hiện nhƣ trong kỹ thuật điện di thông thƣờng.
- Ƣu điểm:
+ Kiểm soát đƣợc lƣợng huỳnh quang giải phóng ra do đó xác định đƣợc lƣợng sản phẩm PCR tại từng thời điểm (chu kỳ) của khuếch đại. Ở kỹ thuật PCR thông thƣờng, gel agarose có nhiều hạn chế nhƣ độ phân giải thấp do vậy định lƣợng thƣờng không chính xác.
+ Độ đặc hiệu cao hơn do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản phẩm khuếch đại.
+ Tiết kiệm thời gian chỉ khoảng 1-2h trong khi PCR truyền thống phải mất từ 3-5h
+ Có hệ thống kín do đó ít có nguy cơ bị tạp nhiễm.
Kỹ thuật realtime PCR đƣợc ứng dụng trong xác định gen kháng kháng sinh nhƣ mecA, van A của S. aureus [98]. Kỹ thuật này đã đƣợc Lance R. Peterson sử dụng để xác định MRSA ở mũi, kết quả trong vòng 2 giờ với độ nhạy từ 95-100%, độ đặc hiệu 96-99% [100].
1.7.2.3. Kỹ thuật PCR lồng (PCR nested)
- Nguyên lý: Là kỹ thuật sử dụng hai cặp mồi xếp lồng vào nhau. Đoạn DNA lớn sinh ra sau vòng một của PCR sẽ dùng để làm mẫu cho PCR lần thứ hai có primer nằm trong primer lần một. PCR lồng bao gồm hai phản ứng đồng thời, phản ứng đầu ở vòng ngoài gene và sản phẩm của nó lại làm khuôn cho phản ứng sau cho đoạn nằm trong gene.
- Ƣu điểm : Kỹ thuật này làm tăng độ nhạy lên đến 104 lần so với của phản ứng PCR thông thƣờng. Mặc dù sản phẩm PCR lần 1 không rõ song các khuôn đích sẽ đƣợc khuếch đại lên nhiều lần nhờ PCR lồng tiếp theo. Còn các sản phẩm phụ trong sản phẩm PCR lần 1 sẽ ít có khả năng gắn với mồi (của PCR lồng lần 2) do vậy sẽ không đƣợc khuếch đại. Dùng cặp mồi đặc hiệu có thể xác định đƣợc gene đặc trƣng cho loài, thậm chí một chủng vi sinh vật nào đó. Đây là lợi thế của kỹ thuật PCR dùng trong xác định typ vi sinh vật trong nghiên cứu dịch tễ học.
- Nhƣợc điểm : Sản phẩm PCR lần 1 không đặc hiệu song lại đủ lớn và có thể làm khuôn cho PCR lồng tiếp theo. Hiện tƣợng này dẫn đến các sản phẩm gen không đặc hiệu cũng sẽ đƣợc khuếch đại và làm sai lệch kết quả [27]. Nghiên cứu của Fred C. Tenover và cộng sự ứng dụng kỹ thuật PCR lồng sử sụng enzyme cắt AluI phân tích gen coagulase trên 59 chủng S. aureus. Mồi phía ngoài là COAG-1 và COAG-4, mồi bên trong là COAG-2 và COAG-3 [115].
1.7.2.4. Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism)
- Nguyên lý : Sử dụng enzym cắt hạn chế để cắt sản phẩm PCR tạo nên những đoạn cắt khác nhau và xác định kết quả sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose hoặc polyacrylamid.
Ứng dụng kỹ thuật RFLP để xác định tính đa hình của gen đƣợc cắt. Ví dụ cắt bằng AluI xác định gen mã hóa coagulase của S. aureus. Tiêu chuẩn phân loại S. aureus dựa vào tính đa hình của gen mã hóa coagulase
(theo nghiên cứu của Su [113] và Goh [50]). Siti Salasia ứng dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu các gen của S. aureus nhƣ hla 73%, cap8 là 91%, fnbA 100% [105].
1.7.2.5. Kỹ thuật PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis: Điện di trường xung)
- Nguyên lý: Sử dụng enzyme cắt giới hạn để cắt DNA tạo ra đƣợc các đoạn (thƣờng từ 10-20 đoạn) có kích thƣớc lớn (40 kb-2000 kb). PFGE tăng khả năng di chuyển của các đoạn DNA lớn trong điện trƣờng nhờ trƣờng điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh DNA có kích thƣớc khác nhau thay đổi hƣớng di động. Các đoạn có kích thƣớc khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau, kích thƣớc càng lớn thì mức di động càng chậm qua gel tạo ra sự phân tách các băng DNA trong trƣờng điện di.
- Ứng dụng : trong nghiên cứu về sự tƣơng đồng, phân loại các chủng, điều tra các vụ dịch, đóng vai trò nhƣ một phƣơng pháp tham chiếu trong xác định kiểu gen, xác định nguồn mang và phƣơng thức lây truyền của một vi khuẩn nào đó [23].
Năm 2011 Yanping Xie và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật này để phân tích sự tƣơng đồng về di truyền của 108 chủng S. aureus phân lập đƣợc ở bệnh viện tại Trung Quốc. Kết quả cho thấy có 80% các chủng tƣơng đồng [126].
1.7.2.6. Kỹ thuật MLST (Multilocus sequence typing)
- Nguyên lý kỹ thuật dựa trên nguyên tắc điện di đoạn gen nhiều locus. Những đoạn (khoảng 500 bp) của gen quan trọng và thiết yếu (thƣờng là 7 gen) sẽ đƣợc nhân lên và giải trình tự. Những trình tự này đƣợc so sánh với trình tự DNA là kết quả của các type của các chủng đã nghiên cứu công bố trên MLST website.
- Ứng dụng: Đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu điều tra dịch tễ. Peacock và cộng sự năm 2002 cho thấy kỹ thuật này có ƣu điểm tƣơng đƣơng nhƣ PFGE để nghiên cứu trong các vụ dịch nhỏ [98]. Yanping Xie và cộng sự khi ứng dụng kỹ thuật này để phân tích tƣơng đồng về di truyền của 108 chủng S. aureus phân lập đƣợc ở bệnh viện tại Trung Quốc cho thấy kỹ thuật này ít có khả năng xác định tính tƣơng đồng hơn PFGE tuy nhiên giải trình tự gen kết hợp với PFGE hoặc MLST sẽ tăng khả năng xác định tính tƣơng đồng về trình tự gen di truyền của các chủng [126].
1.7.2.7. Giải trình tự gen
Hai phƣơng pháp chính xác định trình tự là phƣơng pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và phƣơng pháp enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). Phƣơng pháp của Sanger đƣợc ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu y sinh học [22]. Phƣơng pháp này dựa vào sự tổng hợp DNA nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ xung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định. Đặc trƣng của phƣơng pháp là ngoài bốn loại nucleotide thông thƣờng còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là những deoxynucleotide trong đó nhóm 3‟OH đƣợc thay bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodiester, do đó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp. Kết quả phản ứng tạo ra các đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau. Sản phẩm đƣợc đem phân tách trên gel polyacrylamide và kết quả đƣợc đọc trên máy tự ghi [27].
1.8. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KIỂU CÁCH CƢ TRÖ VÀ GEN ĐỘC LỰC CỦA
S. AUREUS
1.8.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Ngộ độc thực phẩm do S. aureus là vấn đề nan giải ở nhiều nƣớc trên thế giới. Nhiều vụ dịch ngộ độc tập thể lớn gây nên thiệt hại nặng nề về cả sức khỏe và kinh tế. Năm 1968 tại một trƣờng học ở Mỹ có 1300 trẻ em ngộ độc do ăn salat làm từ thịt gà nhiễm vi khuẩn. Năm 2000 tại Osaka, Nhật có 13420 ngƣời ngộ độc do uống sữa ít chất béo nhiễm S. aureus. Tại Pháp năm 2008 có 47 ngƣời ngộ độc trong đám cƣới do ăn thịt nhiễm S. aureus [61]. Tình trạng mang S. aureus ở những nhân viên nhà hàng, những ngƣời làm trong cơ sở dịch vụ ăn uống, chế biến và tiếp xúc với thức ăn là nguy cơ tiềm ẩn gây nên các vụ dịch ngộ độc thức ăn. S. aureus có thể ô nhiễm thức ăn nhƣ thịt, trứng, sữa qua động vật mang vi khuẩn này khi chúng bị bệnh nhiễm trùng, viêm tuyến vú [95]. Tuy nhiên, nguồn gây ô nhiễm chính S. aureus vào thực phẩm lại là con ngƣời chiếm đến 84% các vụ dịch ngộ độc thực phẩm trong quá trình sản xuất, chế biến, tiếp xúc với thức ăn. S. aureus
ô nhiễm thực phẩm thông qua tiếp xúc nhƣ bàn tay ngƣời, vết thƣơng ở tay, da, tóc, mụn nhọt, áp xe hoặc qua đƣờng hô hấp nhƣ ho, xì mũi, hắt hơi [76]. Ngày nay, với kỹ thuật PFGE chúng ta xác định đƣợc nguồn gốc các chủng, căn nguyên các vụ ngộ độc thực phẩm. Chủng phân lập trong các vụ dịch có chung nguồn gốc với chủng từ nhân viên chế biến thực phẩm. Chính vì vậy, nhân viên này là nguồn lây nhiễm vi khuẩn [123].
Tỷ lệ mang vi khuẩn ở nhóm nhân viên tiếp xúc với thực phẩm khoảng 20 - 40% theo nhiều nghiên cứu khác nhau [46], [67]. Các chủng S. aureus phân lập đƣợc từ nhân viên nhà ăn cũng cho thấy có tỷ lệ kháng kháng sinh và chứa các gen độc lực nhƣ các gen độc tố ruột se: sea, seb, sec, sed, see…(80 - 90%) [42].
Những nghiên cứu cho thấy ở ngƣời bình thƣờng có khoảng 20% (dao động từ 12 - 30%) mang S. aureus thƣờng xuyên, 30% mang không thƣờng xuyên (16 - 70%) và 50% (16 - 69%) không mang S. aureus [57]. Tiêu chuẩn đánh giá kiểu cách cƣ trú vi khuẩn dựa vào sự có mặt của S. aureus ở từng lần lấy bệnh phẩm ở mũi vì lỗ mũi là vị trí cƣ trú ổn định của vi khuẩn này và ít chịu tác động của các yếu tố bên ngoài nhƣ tình trạng vệ sinh. Đây là vị trí thích hợp đƣợc lựa chọn để nghiên cứu kinh điển về tình trạng mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus [119]. Nghiên cứu của Nouwen và cộng sự, so sánh giữa lấy mẫu 12 lần và 2 lần ở mũi, mỗi lần cách nhau 1 tuần để xác định kiểu cách cƣ trú của S. aureus. Kết quả cho thấy tỷ lệ mang thƣờng xuyên lần lƣợt là 29% và 30%, không thƣờng xuyên là 31% và 16% và không mang là 40% và 54%. Nếu nghiên cứu kéo dài thì tỷ lệ mang không thƣờng xuyên sẽ tăng lên và tỷ lệ mang thƣờng xuyên sẽ giảm đi. Số lần lấy mẫu tối thiểu là 3 - 4 lần để xác định là mang thƣờng xuyên [90]. Một số nghiên cứu khác cho thấy lấy mẫu 2 lần mỗi lần cách nhau 1-2 tuần là thích hợp để xác định kiểu cách cƣ trú [68], [91].
Theo những nghiên cứu điều tra ngang thì tỷ lệ mang S. aureus
khoảng 27% từ năm 2000. Tỷ lệ này thấp hơn tỷ lệ 35% ở những nghiên cứu trƣớc từ năm 1934. Điều này có thể giải thích đƣợc là do những thay đổi tốt hơn về vệ sinh cá nhân, về kinh tế xã hội và gia đình ít thành viên hơn [57].
Các nghiên cứu trên nhân viên làm việc tại các cơ sở dịch vụ ăn uống, chế biến và tiếp xúc với thức ăn đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tỷ lệ mang và đặc điểm cƣ trú và các gen độc tố ruột của S. aureus trên nhóm đối tƣợng này có ý nghĩa quan trọng trong công tác phòng chống, kiểm soát các vụ ngộ độc thực phẩm [62]. Nghiên cứu của Jonge ở Hà Lan năm 2010 cho thấy tỷ lệ mang S. aureus ở mũi và tay của nhân viên nhà ăn là 33% và tỷ lệ này ở ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh ở Hà Lan là 30% [67]. Kết quả của một nghiên cứu khác cùng năm của Borges tại Brazil ở nhân
viên chế biến thức ăn về tỷ lệ mang là ở mũi 14,7%, ở cả tay và mũi là 1,4% [37].
Nghiên cứu tỷ lệ trên tay nhân viên nhà ăn cho kết quả dao động khác nhau từ 2-20%. Tỷ lệ mang vi khuẩn này ở tay nhân viên làm việc trong quán cà phê sinh viên ở các trƣờng đại học của Gashaw Andargie năm 2008 tại Ethiopia [47] và của Soares M.J. trên nhân viên bếp ăn tại bệnh viện và trong cộng đồng năm 1997 tại Brazil là 16,5% [110]. Nghiên cứu khác của Borges J. Liana tại Brazil ở nhân viên chế biến thức ăn năm 2010 là 2,9% [37] và của Johan N. Bruun năm 1973 là 10,2% [66]. Sospedra và cộng sự năm 2012 tại Tây Ban Nha nghiên cứu 53 chủng S. aureus từ nhân viên nhà ăn cho thấy tỷ lệ mang vi khuẩn này ở tay là 8,4% [111].
Khi nghiên cứu về mối liên quan giữa kích ứng mũi và mang S. aureus
ở mũi, Wertheim và cộng sự nhận thấy 71,4% những ngƣời có kích ứng mũi mang S. aureus đối lại với 40% mang S. aureus ở những ngƣời không bị kích ứng mũi, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,023. Nhƣ vậy kích ứng mũi đóng vai trò quan trọng của mang vi khuẩn này ở mũi [124].
Các gen độc lực giúp S. aureus sản xuất ra các độc tố gây ra các tình trạng nhiễm trùng khác nhau trên lâm sàng [79]. Nghiên cứu của Jana Maslankova và cộng sự trên các gen sea, seb, sec, sed, see, tst-1, eta, etb, cna, spa cho thấy 75% các chủng S. aureus có chứa một trong các gen độc tố trên [84]. Một nghiên cứu khác cho thấy, 64% (101/157) số chủng S. aureus
phân lập từ tủ lạnh của các hộ gia đình ở Irland có ít nhất 2 trong số những gen qui định độc tố ruột kể trên. Nghiên cứu của Morandi tại Italy xác định 16 genotype khác nhau của gen coa ở 25 chủng S. aureus [86]. Xác định căn