Coagulase là một trong những yếu tố độc lực ngoại tiết của S. aureus. Đây là enzyme làm đông huyết tƣơng và là một chỉ điểm để phân biệt S. aureus với các tụ cầu khác. Phƣơng pháp thông dụng và cổ điển xác định khả năng sinh coagulase (coagulase tự do và coagulase liên kết) sau khi đã phân lập của S. aureus nhƣ đông huyết tƣơng, ngƣng kết trên phiến kính đƣợc ứng dụng phổ biến trong phòng xét nghiệm. Bên cạnh đó, hiện nay có thể phát triển kỹ thuật phát hiện gen coagulase để nghiên cứu sâu hơn ở mức phân tử về vi khuẩn này.
Xác định gen mã hóa coagulase chính là xác định khả năng sản xuất coagulase (không có gen mã hoá coagulase do đó không sản xuất đƣợc coagulase). Nó còn là tiêu chuẩn phân loại các chủng S. aureus gây nhiễm khuẩn ở ngƣời. Ngƣời ta đã xác định đƣợc nhiều dạng alen của gen này ở S. aureus. Mỗi chủng S. aureus có thể tạo ra một biến thể enzyme. Một số thí nghiệm phân tích trình tự DNA của các gen này từ một số chủng S. aureus
cho thấy nguyên nhân là do thay đổi trình tự gen trong vùng mã hóa ở vùng 3‟ của gen coagulase.
Phân loại các genotype của S. aureus dựa vào tính đa hình của gen mã hóa coagulase có ƣu điểm đơn giản, nhanh, có khả năng phân loại chính xác các chủng S. aureus dựa vào các mảnh DNA đƣợc cắt bằng enzyme AluI. Việc phân loại này có thể đƣợc ứng dụng trong xác định dịch tễ học phân tử và phân loại các chủng S. aureus phân lập từ các nguồn khác nhau. Nghiên cứu của Haluk cho thấy có mối liên quan giữa coagulase và khả năng sinh độc tố ruột. [54].
Gen mã hóa coagulase có tính đa hình thái. Phân loại dựa vào gen mã hóa coagulase đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và có ý nghĩa quan trọng trong xác định, nghiên cứu vi khuẩn này [29].
4.2.1.1. Tính đa dạng của gen mã hóa coagulase
Theo kết quả ở bảng 3.23, chúng tôi đã xác định đƣợc 20 genotype của gen mã hóa coagulase trong 101 chủng S. aureus phân lập đƣợc bằng kỹ thuật RFLP. Có tất cả 6 đoạn cắt có kích cỡ lần lƣợt là 85, 165, 250, 465, 550 và 800 bp đƣợc xác định.
Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu genotype gen mã hóa coagulase của một số tác giả
Tác giả Năm Địa điểm Số chủng
S. aureus
Số genotype
Chúng tôi 2012 Việt Nam 101 20
Moradi Stefano [85] 2008 Italy 25 16
Elizabete Rodrigues [104] 2005 Brazil 64 49
Su. C [113] 1999 Mỹ 425 40
Hinmabindu [58] 2009 Ấn Độ 66 19
Swee-han Goh [50] 1992 Canada 69 19
Schwarzkopf [109] 1994 Đức 30 6
Nghiên cứu của chúng tôi là một bằng chứng về tính đa dạng của gen mã hóa coagulase, phù hợp với nhiều nghiên cứu khác trên thế giới. Nghiên cứu của Moradi Stefano năm 2008 tại Italy trên 25 chủng đã phân loại đƣợc 16 genotype khác nhau [85]. Nghiên cứu của Elizabete Rodrigues năm 2005 tại Brazil phân loại 49 genotype trên 64 chủng S. aureus. Nghiên cứu này sử dụng phƣơng pháp nhƣ trong nghiên cứu của chúng tôi, ứng dụng kỹ thuật RFLP và enzyme cắt AluI [104].
Nghiên cứu của Su.C năm 1999 trên 425 chủng S. aureus cho thấy kết quả 40 genotype. Phƣơng pháp nghiên cứu của Su sử dụng phối hợp 2 loại enzyme cắt là AluI và HaeIII để phân loại gen coagulase khác so với nghiên cứu của chúng tôi chỉ sử dụng 1 loại enzyme AluI [113]. Kết quả nghiên cứu của M. Hinmabindu năm 2009 tại Ấn Độ trên 66 chủng S. aureus kết quả 19 genotype [58]. Swee-han Goh và cộng sự ứng dụng kỹ thuật PCR RFLP cũng phân loại 19 genotype trên 69 chủng S. aureus [50]. Theo nghiên cứu của Schwarzkopf và cộng sự trên 30 chủng S. aureus phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng, mũi của bệnh nhân và nhân viên y tế, cũng có 6 genotype đƣợc phát hiện [109].
Christine Lawrence tại Pháp đã nghiên cứu trên 86 chủng và cho thấy có tới 79 chủng có cùng một loại genotype. Tỷ lệ một loại genotype chiếm ƣu thế (90%). Nghiên cứu này sử dụng enzyme cắt HaeIII khác so với nghiên cứu của chúng tôi. Các nghiên cứu của Satozu Kitai (52,9%) [75], Elizabete Rodriguesb de Silva [104], Su.C, M. Hinmabindu cho thấy có 1 (15,5%) hoặc một vài (3 đến 5) genotype chiếm ƣu thế [113]. Trong các nghiên cứu, các tác giả ở các nƣớc khác nhau sử dụng phối hợp 2 loại enzyme cắt là AluI và HaeIII để phân loại gen coagulase nhằm làm tăng tính đa dạng các genotype của gen coagulase.
Sự đa dạng của gen mã hóa coagulase đƣợc xác định không những ở các chủng S. aureus phân lập từ ngƣời mà cả những chủng phân lập từ động vật, và tại những vùng địa lý khác nhau [29]. Ngƣời ta thấy rằng, xét về góc độ đa dạng của kiểu gen, việc xác định các genotype của S. aureus đã đƣợc chứng minh là một phƣơng tiện đơn giản, chính xác và rất có giá trị trong việc phân loại các chủng S. aureus [85].
Việc xác định genotype S. aureus là cơ sở để đánh giá dịch tễ học phân tử các chủng S. aureus. Trong nghiên cứu của chúng tôi, genotype 6
gặp phổ biến nhất với 3 đoạn cắt, chiếm tỷ lệ 53,47% tổng số chủng S. aureus phân lập đƣợc. Điều này cho thấy có sự chiếm ƣu thế của chủng S. aureus mang genotype 6.
Bảng 3.24 cho thấy, các genotype phân bố với tỷ lệ khác nhau ở các chủng phân lập đƣợc từ mũi và tay. Phân tích các chủng ở mũi và tay, chúng ta đều nhận thấy rằng tỷ lệ genotype 6 chiếm ƣu thế (49,35% ở mũi và 66,77% ở tay), vị trí thứ 2 là genotype 12 (6,49% ở mũi và 8,33% ở tay) và genotype 1 (6,49 % ở mũi và 4,17% ở tay), vị trí thứ 3 là genotype 1 (3,9% ở mũi và 12,5% ở tay). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng, trong số các chủng S. aureus phân lập đƣợc từ mũi genotype 6 chiếm tỷ lệ cao nhất (49,5%), tiếp theo là genotype 1 và 12 (6,49%). Ở những chủng phân lập từ tay, genotype 6 cũng chiếm ƣu thế (66,77%), sau đó là genotype 2 (12,5%). Tuy nhiên vì số lƣợng mỗi loại genotype của các chủng phân lập đƣợc chƣa đủ lớn để xác định ý nghĩa thống kê của sự khác biệt này. Tác giả Su đề xuất cần có thêm những nghiên cứu sâu hơn, đầy đủ hơn về những chủng, genotype chiếm ƣu thế. Đây sẽ là những nghiên cứu rất cần thiết để chúng ta hiểu biết sâu sắc hơn về cơ chế gây bệnh, đặc điểm cƣ trú, dịch tễ học phân tử của vi khuẩn này [113].
4.2.1.2. Phân bố số lượng các genotype mã hóa coagulase
Nếu chỉ tính sự có mặt của các chủng và genotype của nó trên 53 nhân viên, kết quả ở bảng 3.25 cho thấy, có 73,58% (39 nhân viên) có 1 genotype. Có 13 trƣờng hợp mang 2 genotype và 1 trƣờng hợp mang 3 genotype trên cùng 1 nhân viên. Không có nhân viên nào mang 4 loại genotype khác nhau. Khi phân tích về genotype của những chủng này, chúng có nhiều tổ hợp kiểu gen khác nhau. Điều này cũng có thể đƣợc giải thích do các chủng S. aureus
khác nhau cùng cƣ trú. Đặc biệt trên 4 nhân viên mang S. aureus thƣờng xuyên ở mũi hoặc ở tay, chúng ta nhận thấy rằng có 3 ngƣời chỉ mang một loại genotype. Kết quả này đóng góp thêm vào nhận định những chủng S.
aureus cƣ trú thƣờng xuyên thƣờng có cùng một kiểu gen. Một số nghiên cứu trƣớc đây cũng cho thấy, ở những ngƣời mà S. aureus cƣ trú theo kiểu cách thƣờng xuyên thì thƣờng có 1 chủng xuất hiện. Ứng dụng kỹ thuật PFGE để xác định độ tƣơng đồng, ngƣời ta nhận thấy có tới 80% các chủng mang thƣờng xuyên có cùng genotype [91].
Các thành viên trong gia đình có ngƣời mang S. aureus có nguy cơ trở thành mang vi khuẩn này. Peacock và cộng sự nghiên cứu về tình trạng mang của các chủng phân lập đƣợc từ mẹ và các con cho thấy phần lớn các chủng này có sự liên quan mật thiết về mặt di truyền. Phần lớn các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ mẹ và con là cùng loại và 65% những chủng vi khuẩn của những ngƣời trong cùng gia đình giống nhau về mặt di truyền. Herwaldt và cộng sự nhận thấy 21% bệnh nhân lọc dịch màng bụng mới mang S. aureus ở mũi có nguồn gốc chủng từ thành viên trong gia đình [98]. Trong nghiên cứu của chúng tôi 13 nhân viên mang 2 loại genotype khác nhau đều là những ngƣời mang S. aureus không thƣờng xuyên. Kiểu cách cƣ trú không thƣờng xuyên hay do nhiều chủng S. aureus trên một cá thể tạo ra. Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng, những chủng hay những genotype của S. aureus chiếm ƣu thế và trở thành các chủng tạo ra kiểu cách cƣ trú thƣờng xuyên thƣờng là các chủng phát triển mạnh, có yếu tố độc lực cao, khả năng thích nghi lớn và lấn át các chủng khác để phát triển [78], [104].