Hình 2.1: Sơ đồ phân lập, xác định S. aureus
Mẫu tăm bông lấy ở mũi và tay đƣợc nuôi cấy, phân lập riêng biệt theo thƣờng qui vi sinh và đƣợc cải tiến dựa vào nghiên cứu của Nouwen và cộng sự [90]. Tóm tắt qui trình nhƣ sau:
+ Mỗi tăm bông lấy mẫu đƣợc ria thành 3 vùng lên 1 đĩa thạch máu. Đĩa thạch máu để ở điều kiện 370
+ Trên thạch máu chọn khuẩn lạc nghi ngờ đục dạng S (tròn, lồi, nhẵn, bóng), có sắc tố hoặc không, có vòng tan huyết hoặc không.
+ Làm tiêu bản nhuộm Gram, nếu soi thấy có hình ảnh cầu khuẩn bắt màu Gram dƣơng xếp thành từng đám thì tiếp tục làm các phản ứng sinh vật hóa học để xác định S. aureus.
- Lên men đƣờng Manitol: Trên môi trƣờng Chapman sau 24 - 48h
S. aureus sẽ làm cho màu của môi trƣờng chuyển từ đỏ sang vàng. Tức là có khả năng lên men đƣờng manitol.
- Xác định sự có mặt của men coagulase:
+ Coagulase liên kết trên phiến kính: Nhỏ một giọt nƣớc muối sinh lý lên phiến kính. Lấy vi khuẩn nghi ngờ nghiền đều: nếu không thấy hiện tƣợng ngƣng kết (nghĩa là, vi khuẩn không tự ngƣng kết) thì nhỏ thêm một giọt huyết tƣơng thỏ lắc đều. Trong vòng 5 giây, nếu thấy vi khuẩn tụ lại thành các hạt nhỏ là coagulase liên kết dƣơng tính. Nếu không có gì thay đổi là coagulase liên kết âm tính. Những trƣờng hợp âm tính phải kiểm tra lại bằng kỹ thuật xác định coagulase tự do.
+ Coagulase tự do:
Dùng nƣớc muối sinh lý, pha loãng huyết tƣơng thỏ thành ¼
Nhỏ vào 3 ống nghiệm vô trùng, mỗi ống 0,5ml huyết tƣơng đã pha loãng
Dùng que cấy lấy tụ cầu mẫu (chủng ATCC 25923) cho vào ống thứ nhất, ống thứ hai để nguyên làm chứng, ống thứ ba cho tụ cầu cần thử. Ủ các ống nghiệm trên ở 37o
C
Đọc kết quả: Sau khi ủ 6 giờ (nếu để quá lâu thì kết quả có thể trở thành âm tính giả, vì nhiều chủng tụ cầu tiết men fibrinolysin làm lỏng huyết tƣơng trƣớc đó đã đông), nếu huyết tƣơng đông lại nhƣ một cục thạch, dốc ống nghiệm lên vẫn không rơi (đông hoàn toàn) hoặc nghiêng ống nghiệm
nhìn thấy có cục đông, xung quanh còn một ít huyết tƣơng không đông (đông không hoàn toàn) thì gọi là coagulase dƣơng tính. Một trong bốn trƣờng hợp sau đây có thể xảy ra trong khi đọc kết quả thử nghiệm này:
Trƣờng hợp 1: Ở ống 1 và ống 3, huyết tƣơng đông; ống 2, huyết tƣơng không đông: coagulase dƣơng tính.
Trƣờng hợp 2: Ở ống 1 huyết tƣơng đông, ống 2 và 3 huyết tƣơng không đông: coagulase âm tính. Để thêm đến 24 giờ ở nhiệt độ phòng, nếu kết quả vẫn không thay đổi thì kết quả là âm tính thực sự.
Trƣờng hợp 3: Ở cả 3 ống, huyết tƣơng đều đông: huyết tƣơng đã hỏng, phải làm lại bằng huyết tƣơng mới.
Trƣờng hợp 4: Ở cả 3 ống, huyết tƣơng đều không đông: tụ cầu mẫu hoặc huyết tƣơng đã hỏng hoặc là hỏng cả hai. Phải kiểm tra riêng rẽ từng yếu tố và làm lại thử nghiệm.
- Kỹ thuật xác định catalase: Dùng que vô trùng (không phải là kim loại) lấy một lƣợng vi khuẩn từ khuẩn lạc cần xác định S. aureus (đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch thƣờng sau 18-24 giờ) lên lam kính. Nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 3% lên trên vi khuẩn ở lam kính và quan sát, nếu thấy hiện tƣợng sủi bọt khí (tạo ra O2): catalase dƣơng tính; không thấy hiện tƣợng sủi bọt khí: catalase âm tính.
- Các tính chất chính đã đƣợc xác định S. aureus [5], [44]. + Cầu khuẩn Gram dƣơng xếp thành từng đám.
+ Có men coagulase. + Có men catalase
+ Lên men đƣờng manit.
- Tiêu chuẩn xác định S. aureus: âm tính
Sau 96 giờ nuôi cấy nếu không thấy khuẩn lạc có tính chất trên xuất hiện. Mẫu xét nghiệm đƣợc coi là âm tính với S. aureus.