Ngày nay đã có nhiều kỹ thuật xác định tụ cầu nhƣ: nhuộm soi, ngƣng kết hạt, Staphylatex, nuclease chịu nhiệt, lysostaphin, định typ phage, ELISA, điện di miễn dịch và thử nghiệm miễn dịch dùng chất phóng xạ…Sau đây là một số kỹ thuật chính đƣợc áp dụng trong phòng xét nghiệm để xác định và nghiên cứu S. aureus.
1.7.1.1. Kỹ thuật nhuộm soi
làm từ bệnh phẩm/mẫu hoặc từ khuẩn lạc.
- Trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm: cầu khuẩn Gram dƣơng, đƣờng kính trung bình 0,8µm, đứng lẫn với tế bào mủ, hoặc tập hợp lại thành hình chùm nho, cũng có khi cầu khuẩn đứng riêng rẽ.
- Trên tiêu bản nhuộm Gram từ khuẩn lạc: S. aureus có hình ảnh cầu khuẩn bắt màu Gram dƣơng xếp thành từng đám [5].
1.7.1.2. Nuôi cấy, phân lập và xác định
Tùy loại bệnh phẩm lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp. Thông thƣờng sử dụng thạch máu 5% ủ ở nhiệt độ 35-370
C từ 18-24h. Tụ cầu khuẩn mọc tốt trên hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy thƣờng dùng, nhiệt độ thích hợp 370
C, pH:7.2-7.4, trong khí trƣờng có oxy hoặc kỵ khí tùy tiện [33]. Trên canh thang: sau 6 giờ tụ cầu đã làm đục đều môi trƣờng, sau 24 giờ có thể có lắng cặn và có váng. Trên thạch thƣờng: Khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵn, bóng, đục, bờ rõ rệt. Sau 24-36 giờ xuất hiện sắc tố màu vàng. Trên thạch máu: khuẩn lạc tròn, ƣớt, bóng, có thể có vòng tan huyết hoặc không. Nếu có vòng tan huyết là vòng tan huyết hoàn toàn, tạo thành một vòng trong xung quanh khuẩn lạc (tan máu β). Trên môi trƣờng Chapman (có đƣờng mannit): S. aureus có khả năng sử dụng mannit làm cho môi trƣờng bị axit hóa, do đó màu môi trƣờng chuyển sang vàng. Khuẩn lạc S. aureus có ánh vàng [7].
Xác định sự có mặt của men coagulase: (men làm đông huyết tƣơng) tự do và liên kết.
Ngoài các tính chất trên, S. aureus còn có khả năng sinh các enzyme dezoxyribonuclease, catalase, phosphatase, kháng novobiocin, gây hoại tử da thỏ. Khi các thử nghiệm khác không rõ có thể sử dụng kit API-STAPH để xác định S. aureus [98].
đoán xác định S. aureus. Tuy nhiên kỹ thuật này cho kết quả khá lâu (từ 3-4 ngày), cần một lƣợng vi khuẩn lớn và không xác định đƣợc các yếu tố ở mức phân tử.
1.7.1.3. Một số kỹ thuật khác
- Kỹ thuật ngƣng kết: Những kit thƣơng mại dựa trên nguyên lý phản ứng ngƣng kết nhƣ: Dry Spot Staphytect Plus, Pastorex Staph Plus, Slidex Staph-Kit, Slidex Staph Plus, Staphaurex Plus, Staphylase, Xpert SA Nasal Complete Cepheid có độ nhạy, độ đặc hiệu cao 96-99% [125].
- Kỹ thuật ELISA: Ƣu điểm của phƣơng pháp: độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Ứng dụng kỹ thật này để xác định độc tố ruột của S. aureus nhƣ SEA, SEB, SEC, SED….Đây là kỹ thuật đƣợc sử dụng từ vài thập kỷ trƣớc nhƣng rất hiệu quả và hiện vẫn đang đƣợc sử dụng, đặc biệt để xác định căn nguyên các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus [15].
- Kỹ thuật xác định bằng phage: sử dụng các nhóm phage để xác định lysotyp S. aureus ở ngƣời:
+ Nhóm I: 29, 52, 52A, 79, 80 + Nhóm II: 3A, 3C, 55, 71
+ Nhóm III : 6, 42E, 47, 53, 54, 75, 77, 83A, 84, 85 + Không xếp hạng : 81, 95, 96 [7]
- Xác định typ huyết thanh: Ƣu điểm của phƣơng pháp này là các kháng huyết thanh có tính đặc hiệu với từng typ huyết thanh của vi khuẩn. Nói chung đây là kỹ thuật khá ổn định.