3. Đối tượng nghiờn cứu
3.4. Khảo sỏt đỏnh giỏ phương phỏp
3.4.1. Khảo sỏt độ lặp lai
Độ lặp lại được dựng để đỏnh giỏ định lượng độ phõn tỏn của cỏc kết quả. Đại lượng này đặc trưng cho độ gần về giỏ trị trung bỡnh của hai hay nhiều phộp đo nhận được trong những điều kiện giống nhau.
Đỏnh giỏ độ lặp dựa trờn độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
- Tớnh giỏ trị trung bỡnh hàm lượng α-tocopherol trong mẫu: Xtb= ∑ = n i x n 1 1 - Độ lệch chuẩn: S= 1 ) ( 1 2 − − ∑ = n x x n i tb i
- Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) =
tb x Sì100
Trong đú: Xi là nồng độ α-tocopherol ở lần chạy thứ i Xtb là nồng độ trung bỡnh của n lần chạy n là số lần chạy lặp lại
3.4.2. Đỏnh giỏ hiệu suất thu hồi của phương phỏp
Để đỏnh giỏ hiệu suất thu hồi của phương phỏp tiến hành phõn tớch mẫu theo quy trỡnh thờn với phương phỏp thờm chuẩn.
Mẫu 1: mẫu bơ khụng cho thờm chuẩn. Mẫu 2: mẫu bơ thờm chuẩn.
Hiệu suất thu hồi được xỏc định theo cụng thức sau: %H = + − ì100% so m m s C C C Trong đú:
%H là hiệu suất thu hồi.
Cs+m là nồng độ tổng chuẩn thờm vào và mẫu thực cú đo được. Cm là nồng độ mẫu thực đo được.
4.1. Khảo sỏt cỏc yếu tố ảnh hưởng đến phộp định lượng α-tocopherol bằng HPLC bằng HPLC
4.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ cột tỏch
Nhiệt độ cột cỏch ảnh hưởng đến quỏ trỡnh phõn tớch vỡ nú ảnh hưởng đến sự chuyển động nhiệt của cỏc phần tử trong mẫu và sự co gión của cột nhất là đối với khớ hậu khắc nghiệt của Nghệ An, nhiệt độ ban ngày và ban đờm cú sự chờnh lệch lớn.
Hiện nay cỏc mỏy sắc ký hiện đại cú trang bị thiết bị điều nhiệt, ta cú thể cài đặt cựng một nhiệt độ cho mỏy trong suốt thời gian phõn tớch. Vỡ vậy đối với thiết bị HPLC hiện đại thỡ kết quả phõn tớch ớt bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ.
Trong luận văn này chỳng tụi khảo sỏt tại cỏc nhiệt độ thay đổi như sau:25, 30, 35 0C, cũn cỏc điều kiện khỏc được giữ nguyờn:
- Thể tớch bơm mẫu: 20μl. - Flow: 1 ml/mim.
- Pha động: 1,4-dioxan/n-hexan: 3/97. Kết quả thu được trỡnh bày ở bảng [4.1.1]
TT Nhiệt độ cột (oC) Thời gian lưu (phỳt) Áp suất (bar)
1 25 1.99 93
2 30 2,025 93
3 35 2.106 77
Bảng 4.1.1. Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ đến phộp định lượng α-tocopherol bằng HPLC
Trong cỏc thớ nghiệm của luận văn này trờn hệ thống HPLC chỳng tụi đặt nhiệt độ là 300C.
4.1.2 Ảnh hưởng của thề tớch bơm mẫu
Thể tớch bơm mẫu ảnh hưởng rất lớn đến khả năng bắt tớn hiệu, thời gian lưu của mẫu và vỡ vậy sẽ ảnh hưởng đến chiều cao của peak tương
ứng. Ở đõy chỳng tụi khảo sỏt thể tớch bơm mẫu từ 3μl đến 10μl, cũn cỏc điều kiện khỏc được giữ nguyờn:
- Áp suất: 24 bar. - Flow: 0,5 ml/mim. - Nhiệt dộ cột: 300C.
- Pha động: 1,4-dioxan/n-hexan: 2/98.
Kết quả thu được trỡnh bày ở bảng [4.1.2] và sắc đồ mục [4.4.2.1]
TT Vbơm (μl) Rt (phỳt) Chiều cao peak
Tớnh đối xứng của peak
1 0,3 4,675 27 Peak cao, cõn đối 2 0,7 3,281 60,2 Peak cao, cõn đối 3 1 2,343 64 Peak nhọn, cõn đối 4 1,3 1,824 69 Peak khụng cõn đối 5 3 4,675 34 Peak nhọn, cõn đối 6 5 2,354 45 Peak nhọn, cõn đối 7 10 4,785 90,7 Peak nhọn, cõn đối
Bảng 4.1.2. Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của thể tớch bơm mẫu đến phộp định lượng α-tocopherol bằng HPLC
Trong cỏc thớ nghiệm của luận văn này trờn hệ thống HPLC chỳng tụi đặt thể tớch bơm là 10μl.
4.1.3. Ảnh hưởng của tốc độ dũng
Tốc độ dũng ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu của mẫu, vỡ vậy sẽ ảnh hưởng đến chiều cao của peak tương ứng. Ở đõy chỳng tụi khảo sỏt tốc độ dũng thay đổi từ 0.3 ml/phỳt đến 1.3 ml/phỳt, cũn cỏc điều kiện khỏc giữ nguyờn:
- Vmẫu: 10μl.
- Nhiệt dộ cột: 300C.
- Pha động: 1,4-dioxan/n-hexan: 2/98.
(ml/min) (phỳt) peak peak peak
1 0,3 7,732 2321 75,5 Peak cao, cõn đối 2 0,5 5,153 795,6 76,2 Peak nhọn,cao, cõn đối 3 0,7 3,281 1002,5 55,7 Peak hơi lệch 4 1 2,343 751,5 62,5 Peak nhọn, cõn đối 5 1,3 1,822 633 73,6 Peak nhọn, cõn đối
Bảng 4.1.3. Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của tốc độ dũng đến phộp định lượng α-tocopherol bằng HPLC
Như vậy tốc độ dũng càng lớn thỡ thời gian lưu càng nhỏ.
Từ cỏc kết quả trờn chỳng tụi chọn tốc độ dũng là 0,5 ml/phỳt để tiến hành cỏc thớ nghiệm khỏc.
4.1.4. Ảnh hưởng của thành phần dung mụi pha động
Thành phần dung mụi pha động ảnh hưởng rất lớn đến kết quả phõn tớch. Nếu như tỷ lệ pha động này khụng được tuõn thủ nghiờm ngặt thỡ sẽ cú tỏc dụng khụng tốt tới sự đối xứng của peak và ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu.
Trong luận văn này chỳng tụi khảo sỏt thành phần pha động 1,4- dioxan/n-hexan thay đổi như sau 0,2/99,8; 0,5/99,5; 1,5/98,5; 2/98; 2,5/97,5; 5/95; 1/99, cũn cỏc điều kiện khỏc được giữ nguyờn:
- Flow: 0,5 ml/mim. - Nhiệt dộ cột: 300C. - Vmẫu: 10μl.
Kết quả thu được trỡnh bày ở bảng [4.1.4] và sắc đồ mục [4.4.2.3]
TT Tỉ lệ pha động Rt (phỳt) Diện tớch peak Chiều cao peak Tớnh đối xứng của peak 1 0,2/99,8 5,162 1153,4 54,9 Peak cõn đối, đẹp 2 0,5/99,5 5,087 925,3 46 Peak xấu, hỏng 3 1,5/98,5 4,745 1049,6 55,9 Peak nhọn, đẹp 4 2/98 4,641 1259,4 63.1 Peak nhọn, đẹp 5 2,5/97,5 4,524 1342,7 55,5 Peak nhọn, đẹp 6 5/96 1,999 983,4 33 Peak xấu, dớnh peak 7 1/99 4,894 959,7 47.5 Peak cõn đối
8 1,2/98.8 5,155 1661,65 159,5 Peak nhọn,cõn đối, đẹp
Bảng 4.1.4. Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của tỉ lệ pha dộng đến phộp định lượng α-tocopherol bằng HPLC
Từ cỏc kết quả trờn chỳng tụi chọn tỉ lệ pha động 1,4-dioxan/n- hexan: 1,2/98,8 để tiến hành cỏc thớ nghiệm khỏc.
4.1.5. Ảnh hưởng của phương phỏp xử lý mẫu
Mỗi giai đoạn xử lý mẫu đều ảnh hưởng đến kết quả phõn tớch. Nhất là đối với quy trỡnh xử lớ mẫu phức tạp như phương phỏp HPLC. Trong quy trỡnh xử lớ mẫu nếu khụng tuõn thủ cỏc bước trong quy trỡnh chuẩn sẽ gõy ra sai số lớn cho kết quả phõn tớch. Việc thờm dung mụi vào để thực hiện quỏ trỡnh chiết cũng rất quan trọng nhất là tỷ lệ của dung mụi và thứ tự đem dung mụi vào mẫu.
4.2. Xõy dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của diện tớch peak vào nồng độ vào nồng độ
Dóy chuẩn α-tocopherol được khảo sỏt cú nồng độ như sau: 10ppm; 20ppm; 45ppm. Phõn tớch cỏc chuẩn với cỏc điều kiờn tối ưu đó khảo sỏt:
- Cột sắc ký: cột sắc ký pha thuận NP-18. - Tốc độ dũng: 0.5 ml/phỳt.
- Pha động: 1,4-dioxan/n-hexan: 1,2/98,8) - Nhiệt độ lũ cột: 300C
- Phỏt hiện: Đo huỳnh quang, bước súng Kớch thớch: 295nm, bước súng phỏt xạ: 330nm.
+ Tiến hành chạy mỏy HPLC thu được kết quả như sau:
Hỡnh 4.2.2. Sắc đồ mẫu chuẩn α-tocopherol cú nồng độ 20ppm
+ Từ kết quả xỏc định phương trỡnh hồi quy tuyến tớnh dựa vào diện tớch cỏc peak.
Nồng độ
chuần Diện tic pic m b R
2
10ppm 874,76288
77,59163 59,09645 0,99936 20ppm 1661,65234
45ppm 3411,18286
Bảng 4.2.1. Diện tớch pic của α-tocopherol tương ứng với từng nồng độ chuẩn
+ Sử dụng chương trỡnh Microsoft Excel để xõy dựng đường chuẩn, ta cú phương trỡnh đường chuẩn xỏc định hàm lượng α-tocopherol như sau:
Phương trỡnh hồi quy của đường chuẩn theo diện tớch peak cú dạng: y = mx +b x là nồng độ, y diện tớch pic
m = 77,59163 b = 59,09645 Hệ số hồi quy tuyến tớnh là R2 =0,99936
Hỡnh 4.2.4. Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tớch pic thu được và nồng độ cỏc chuẩn α-tocopherol
+ Từ giỏ trị diện tớch peak đo được ta tớnh được hàm lượng C (mg/g). + Sau đú ta tớnh hàm lượng α-tocopherol (mg/g) cú trong mẫu bơ và xốt trứng gà tươi theo cụng thức:
C = (C0/ m) .Vdm.f
Trong đú: C: nồng độ α-tocopherol cú trong mẫu tớnh bằng (mg/g) Co: nồng độ α-tocopherol trong dịch chiết từ đường chuẩn (ppm) Vdm: Thể tớch bỡnh định mức mẫu(ml)
f : hệ số pha loóng (nếu cú) m :khối lượng mẫu (mg)
Mẫu Cỏc mẫu C0 (ppm)
Khối lượng
mẫu (mg) Diện tich pic C (mg/g)
1 Bơ 5.44835 2,0006.103 481,84274 0,067901 2 Xốt trứng gà tươi 7.98866 2,0003.103 678,94958 0,099843
Bảng 4.2.2. Kết quả phõn tớch hàm lượng α-tocopherol trong mẫu xốt trứng gà tươi và mẫu bơ
+ Hàm lượng α-tocopherol (ppm) cú trong mẫu dầu gấc được tớnh theo cụng thức: C = (C0/ V) .Vdm.f
Trong đú: C : nồng độ α-tocopherol cú trong mẫu tớnh bằng (ppm) Co: nồng độ α-tocopherol trong dịch chiết tớnh từ đường chuẩn (ppm) V : Thể tớch lấy của mẫu lấy để phõn tớch (ml)
Vdm: Thể tớch bỡnh định mức mẫu(ml) f : hệ số pha loóng (nếu cú)
Mẫu Cỏc mẫu C0 (ppm) Thể tớch mẫu (ml)
Diện tich
peak C (ppm)
1 Dầu gấc 16,10281 5ml 1308,53931 161,0281
Bảng4.2.3. Kết quả phõn tớch hàm lượng α-tocopherol trong mẫu dầu gấc
4.3. Đỏnh giỏ phương phỏp
Theo lý thuyết thống kờ, cỏc đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại là độ lệch chuẩn SD và hệ số biến thiờn CV% (RSD).
Thực hiện phõn tớch 2.0003g mẫu bơ, 2.0006g mẫu xốt và 5ml mẫu dầu gấc tiến hành phõn tớch lặp lại 3 lần trong cựng một điều kiện. Kết quả phõn tớch 3 lần lặp lại và độ lặp lại của phương phỏp được nờu ra ở bảng 4.3.1.1 và 4.3.1.2. Độ lặp lại của phương phỏp được đỏnh giỏ qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Dựa vào nồng độ tương ứng tớnh kết quả trung bỡnh và tớnh độ lệch chuẩn cũng như hệ số biến thiờn theo cụng thức dưới đõy:
TT Mẫu xốt trứng gà Mẫu bơ
m (g) Nồng độ (mg/g) M(g) Nồng độ (mg/g) 1 2,0006 0,099843 2,0003 0,067901 2 2,0006 0,099154 2,0003 0,067253 3 2,0006 0,098732 2,0003 0,067615 Xtb 0,099243 0,06759 S 0,000561 0,000325 CV(%) 0,565 0,481
Bảng 4.2.1.1 Kết quả trung bỡnh, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiờn của mẫu xốt và bơ
- Giỏ trị trung bỡnh hàm lượng α-tocopherol trong mẫu xốt trứng gà là: Xtb= ∑ = n i x n 1 1 =0,095243 Độ lệch chuẩn: S= 1 ) ( 1 2 − − ∑ = n x x n i i tb =0,000561
Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) =
tb x Sì100
=0,565%
- Giỏ trị trung bỡnh hàm lượng α-tocopherol trong mẫu bơ là: Xtb= ∑ = n i x n 1 1 =0,06759
Độ lệch chuẩn: S= 1 ) ( 1 2 − − ∑ = n x x n i tb i =0,000325
Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) =
tb x Sì100
=0,481% Trong đú: Xi là nồng độ α-tocopherol ở lần chạy thứ i Xtb là nồng độ trung bỡnh của n lần chạy n là số lần chạy lặp lại TT Mẫu Thể tớch (ml) Nồng độ (ppm) 1 5,0 16,10281 2 5,0 16,10342 3 5,0 16,10378 Xtb 16,10334 S 0,00049 CV(%) 0.003
Bảng 4.3.1.2. Kết quả trung bỡnh, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiờn mẫu dầu gấc
- Giỏ trị trung bỡnh hàm lượng α-tocopherol trong mẫu dầu gấc: Xtb=1 16,10334 1 = ∑ = n i x n Độ lệch chuẩn: S= 0,00049 1 ) ( 1 2 = − − ∑ = n x x n i i tb
Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%)= ì100 =0.003%
tb x S
Trong đú: Xi là nồng độ của α-tocopherol ở lần chạy thứ i Xtb là nồng độ trung bỡnh của n lần chạy
n là số lần chạy lặp lại
Để đỏnh giỏ hiệu suất thu hồi của phương phỏp tiến hành phõn tớch mẫu theo quy trỡnh thờn với phương phỏp thờm chuẩn.
Mẫu 1: mẫu bơ khụng thờm chuẩn.
Mẫu 2: mẫu bơ thờm 0,5ml chuẩn α-tocopherol nồng độ 10ppm. Hiệu suất thu hồi được xỏc định theo cụng thức sau:
%H = + − ì1000ì100% so m m s C C C
Trong đú: %H là hiệu suất thu hồi.
Cs+m là nồng độ tổng chuẩn thờm vào và mẫu thực cú đo được. Cm là nồng độ mẫu thực đo được.
Cso là nồng độ chuẩn biết trước.
Mẫu Số lần m (mg) Cm và Cs+m Cso H%
1 1 2,0006.103 0,068084 0
2 1 2,0006. 103 0.080087 10,51230 114.18 2 2,0006.103 0,080114 10,51230 114.43 3 2,0006. 103 0,080098 10,51230 114.28
Bảng 4.3.2.1. Kết quả xỏc định hiệu suất thu hồi của phương phỏp đối với mẫu bơ
Từ kết quả trờn ta cú giỏ trị trung bỡnh H% của mẫu bơ là: Htb (%) = ∑ = = n i X n 1 1 114,296 % Độ lệch chuẩn: s = 1 ) ( 1 2 − − ∑ = n x x n i tb i = 0,1258
Trong đú: xi là nồng độ của α-tocopherol ở lần chạy thứ i x là nồng độ của n lần chạy
n số lần chạy lặp lại
Độ lệch chuẩn tương đối: CV (%)= ì100=
x s
0,11%
Qua kết quả phõn tớch cho thấy, phương phỏp cú độ đỳng cao, hiệu suất thu hồi cao. Đỏp ứng nhu cầu phõn tớch.
4.4.1. Sắc đồ mẫu
Hỡnh 4.4.1.2. Sắc đồ mẫu bơ
Hỡnh 4.4.1.4. Sắc đồ mẫu bơ thờm chuẩn α-tocopherol
4.4.2. Sắc đồ khảo sỏt phương phỏp
4.4.2.1. Sắc đồ khảo sỏt thể tớch bơm mẫu
Hỡnh 4.4.2.1.2 Sắc đồ khảo sỏt thể tớch bơm mẫu tại V=3μl
4.4.2.2 Sắc đồ khảo sỏt sự ảnh hưởng của tốc độ dũng
Hỡnh 4.4.2.2.1 Sắc đồ khảo sỏt ở tốc độ dũng 0,7ml/phỳt
Hỡnh 4.4.2.2.3. Sắc dồ khảo sỏt ở tốc độ dũng 1,3ml/phỳt
4.4.2.3 Sắc đồ khảo sỏt sự ảnh hưởng của tỷ lệ pha động
Hỡnh 4.4.2.3.1. Sắc đồ khảo sỏt ở tỷ lệ pha động 1,4-dioxan/n-hexan:5/95
Hỡnh 4.4.2.3.2 Sắc đồ khảo sỏt ở tỷ lệ pha động 1,4-dioxan/n hexan:0.2/99,8
Hỡnh 4.4.2.3.3 Sắc đồ khảo sỏt ở tỷ lệ pha động 1,4-dioxan/n- hexan:0,5/95,5
Hỡnh 4.4.2.3.5 Sắc đồ khảo sỏt ở tỷ lệ pha động 1,4-dioxan/n-hexan: 1,5/98,5
Hỡnh 4.4.2.3.6 Sắc đồ khảo sỏt ở tỷ lệ pha động 1,4-dioxan/n-hexan: 2/98
Hỡnh 4.4.2.3.7 Sắc đồ khảo sỏt ở tỷ lệ pha động 1,4-dioxan/n-hexan: 2,5/97,5
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1. Kết luận
Căn cứ vào nhiệm vụ của đề tài, luận văn đó hoàn thành được những nhiệm vụ sau:
+ Về lý thuyết:
- Lý thuyết về phương phỏp sắc ký lỏng cao ỏp (HPLC). - Lý thuyết chung về vitamin E.
+ Về thực nghiệm:
- Nghiờn cứu quy trỡnh xỏc định hàm lượng α-tocopherol trong một số thực phẩm.
- Khảo sỏt được cỏc yếu tố ảnh hưởng đến việc định lượng α- tocopherol trong thực phẩm bằng phương phỏp HPLC.
- Đó xỏc định được hàm lượng α-tocopherol trong một số thực phẩm: Bơ, xốt trứng gà tươi và dầu gấc.
5.2. Đề xuất
Như chỳng ta đó biết vấn đề sử dụng vitamin E điều trị bệnh thiếu vitamin E trong thực phẩm cũng như trong cỏc sản phẩm từ rau quả, được coi là một tiến bộ của khoa học và cụng nghệ ỏp dụng trong y học và đời sống sức khỏe. Tuy nhiờn chỳng ta khụng nờn lạm dụng hoặc xem thường cỏch sử dụng vitamin E mà dẫn đến cỏc biến tớnh cú thể xảy ra.
- Với kết quả thu được ở luận văn này cho biết hàm lượng α-