3. Đối tượng nghiờn cứu
1.3.5. Hệ thống HPLC
Gồm cú cỏc bộ phận cơ bản sau: - Hệ thống cung cấp dung mụi. - Bơm cao ỏp và bộ trộn dung mụi. - Hệ thống đưa mẫu vào cột.
- Cột sắc ký. - Detectoc.
- Hệ thống ghi nhận tớn hiệu và xử lý kết quả.
Hỡnh 1.3.5.1. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100
Hỡnh1.3.5.2 sơ đồ nguyờn lý của mỏy sắc ký lỏng hiệu năng cao Trong đú: 1: Bỡnh chứa pha động. 2: Bộ phận khử khớ. 3: Bơm cao ỏp. 4: Bộ phận tiờm mẫu. 5: Cộ sắc ký (pha tĩnh). 6: Đầu dũ.
7: Hệ thống mỏy tớnh cú phần mềm ghi nhận tớn hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống.
8: In dữ liệu.
Hiện tại mỏy HPLC thường cú 4 đường dung mụi vào đầu bơm cao ỏp. Cho phộp chỳng ta sử dụng 04 bỡnh chứa dung mụi cựng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung mụi của 04 đường là 100%.
Tuy nhiờn theo kinh nghiệm thỡ chỳng ta ớt khi sử dụng 4 đường dung mụi cựng một lỳc mà chỳng ta chỉ sử dụng tối đa là 3 và 2 đường để cho hệ pha động luụn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quỏ trỡnh rửa giải ổn định. Hiện 4 đường dung mụi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradial dung mụi theo thời gian và cụng tỏc xõy dựng tiờu chuẩn.
Lưu ý:
- Tất cả cỏc dung mụi dựng cho HPLC đều phải là dung mụi tinh khiết và cú ghi rừ trờn nhón là dựng cho HPLC hay dung mụi tinh khiết phõn tớch.
- Tất cả cỏc húa chất dựng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là húa chất tinh khiết phõn tớch.
- Nhằm mục đớch trỏnh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra cỏc Peak tạp trong quỏ trỡnh phõn tớch.
1.3.5.2. Bộ khử khớ Degasse
Mục đớch của bộ khử khớ nhằm loại trừ cỏc bọt nhỏ cũn sút lại trong dung mụi pha động. Nếu như trong quỏ trỡnh phõn tớch mà dung mụi pha động cũn sút cỏc bọt khớ thỡ một số hiện tượng sau đõy sẽ xảy ra:
- Tỷ lệ pha động của cỏc đường dung mụi lấy khụng đỳng sẽ làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi.
- Trong trường hợp bọt quỏ nhiều bộ khử khớ khụng thể loại trừ hết được thỡ cú thể sẽ khụng hỳt được dung mụi, khi đú ỏp suất khụng lờn và mỏy sắc ký sẽ ngừng hoạt động.
Mục đớch để bơm pha động vào cột thực hiện quỏ trỡnh chia tỏch sắc ký. Pump phải tạo được ỏp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến -500 at (1at =0.98 Bar) và pump phải tạo dũng liờn tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phỳt (hiện nay đó cú nhiều loại Pump cú ỏp suất rất cao lờn đến 1200 bar).
Mỏy sắc ký lỏng của chỳng ta hiện nay thường cú ỏp suất tối đa 412 Bar. Tốc độ dũng: 0.1-9.999 ml/phỳt. Tốc độ bơm là hằng định theo thụng số đó được cài đặt. Hiện tại bơm cú 2 pistone để thay phiờn nhau đẩy dung mụi liờn tục.
1.3.5.4. Bộ phận tiờm mẫu (injection)
Dựng để đưa mẫu vào cột phõn tớch. Cú 2 cỏch lấy mẫu vào trong cột: Bằng tiờm mẫu thủ cụng (tiờm bằng tay) và tiờm mẫu tự động(Autosample).
1.3.5.5. Cột sắc ký
Cú rất nhiều nhón hiệu cột khỏc nhau hiện bỏn trờn thị trường. Chỳng được chia làm nhiều loại theo mục đớch sử dụng, trong đú chủ yếu là: cột pha đảo RP C18 (ODS), cột pha thường C8, cỏc loại cột chuyờn dụng cho từng nhúm chất. Cột C18 và C8 được sử dụng cho phần lớn cỏc hợp chất thụng thường.
Cột chứa pha tĩnh được coi là trỏi tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Cột pha tĩnh thụng thường làm bằng thộp khụng rỉ, chiều dài cột khoảng 10-30cm, đường kớnh trong 1-10mm.
Thụng thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đó được Silan húa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta cũn dựng cỏc loại hạt khỏc như: nhụm oxit, polyme xốp, chất trao đổi ion.
Đối với một số phương phỏp phõn tớch đũi hỏi phải cú nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phũng thỡ cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column).
1.3.5.6. Đầu dũ (Detector)
Là bộ phận phỏt hiện cỏc chất khi chỳng ra khỏi cột và cho cỏc tớn hiệu ghi trờn sắc ký đồ để cú thể định tớnh và định lượng. Tựy theo tớnh chất của cỏc chất cần phõn tớch mà người ta sử dụng loại Detector thớch hợp và phải thoả món điều kiện trong một vựng nồng độ nhất định của chất phõn tớch.
A = k.C Trong đú: A: là tớn hiệu đo được
C : Nồng độ chất phõn tớch
K : là hằng số thực nghiệm của Detector đó chọn
Tớn hiệu này cú thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phỏt xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất …
Trờn cơ sở đú người ta chế tạo cỏc loại Detector sau:
- Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phỏt hiện UV.
- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phỏt hiện cỏc chất hấp thụ quang và đõy là loại thụng dụng nhất.
- Detector huỳnh quang dễ phỏt hiện cỏc chất hữu cơ phỏt huỳnh quang tự nhiờn cũng như cỏc chất cú huỳnh quang và là loại Detector cú độ chọn lọc cao nhất.
Loại hiện đại hơn cú Detector Diod Array, ELSD (Detector tỏn xạ bay hơi) cỏc Detector này cú khả năng quột chồng phổ để định tớnh cỏc chất theo độ hấp thu cực đại của cỏc chất. Ngoài ra cũn cú một số loại Detector khỏc là:
- Detector điện húa: Đo dũng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng…
- Detector chiết suất vi sai: Detector khỳc xạ (thụng thường dựng cho đo cỏc chất đường).
- Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt…
1.3.5.7. Bộ phận ghi tớn hiệu
Dựng để ghi tớn hiệu phỏt hiện do Detector truyền sang. Trong cỏc mỏy thế hệ cũ thỡ sử dụng mỏy ghi đơn giản cú thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tớch của Peak, chiều cao…
Cỏc mỏy thế hệ mới đều dựng phần mềm chạy trờn mỏy tớnh nú cú thể lưu tất cả cỏc thụng số của Peak như tớnh đối xứng, hệ số phõn giải... trong quỏ trỡnh phõn tớch đồng thời xử lý, tớnh toỏn cỏc thụng số theo yờu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD...
1.3.5.8. In kết quả
Sau khi đó phõn tớch xong cỏc mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tớnh toỏn ra giấy để hoàn thiện.