3. Đối tượng nghiờn cứu
1.2.7. Nhu cầu sử dụng vitami nE
Viatmin E là một loại vitamin tan trong dầu nờn nhu cầu của nú phụ thuộc vào hàm lượng axit bộo chưa no cú trong thực phẩm. Khi PUFA (axit bộo khụng bóo hũa) ăn vào tăng lờn thỡ lượng vitamin E cung cấp cú thể tăng lờn gấp 4 lần, nghĩa là khoảng từ 5mg-20mg một ngày.
Nhu cầu bỡnh thường cần khoảng 14-19mg trong 24 giờ. Nếu thực phẩm chứa 30g axit linoleic thỡ cần cung cấp thờm 30g α-tocopherol. Vitamin E được dựng như chất dinh dưỡng hỗ trợ cho việc bảo vệ cơ thể chống lại một số loại bệnh món tớnh như bệnh tim, ung thư, đỏi thỏo đường. Nếu dựng vitamin E tổng hợp thỡ cần phải tăng lượng cung cấp lờn khoảng 1,4 lần.
Đối tượng Độ tuổi Nam mg/ngày
(IU/ ngày)
Nữ mg/ngày (IU/ ngày)
Trẻ sơ sinh 0-6 thỏnh 4 mg (6 IU) 4 mg (6 IU) Trẻ sơ sinh 7-12 thỏng 5 mg (7.5 IU) 5 mg (7.5 IU)
Trẻ em 1-3 tuổi 6 mg (9 IU) 6 mg (9 IU) Trẻ em 4-8 tuổi 7 mg (10.5 IU) 7 mg (10.5 IU) Trẻ em 9-13 tuổi 11 mg (16.5 IU) 11 mg (16.5 IU) Thanh niờn 14-18 tuổi 15 mg (22.5 IU) 15 mg (22.5 IU) Người trưởng thành ≥ 19 tuổi 15 mg (22.5 IU) 15 mg (22.5 IU) Phụ nữ cú thai Mọi độ tuổi - 15 mg (22.5 IU) Phụ nữ sau khi sinh Mọi độ tuổi - 19 mg (28.5 IU)
Bảng 1.2.7. Nhu cầu RRR-α-tocopherol ( D-α-tocopherol) đối với cỏc độ tuổi [22]
Sự thiếu hụt vitamin E lõm sàng liờn quan đến sự kộm hấp thu và tớnh bất thường trong sự vận chuyển lipid.
Cỏc đối tượng cú nguy cơ thiếu hụt vitamin E: - Người mắc bệnh kộm hấp thu chất bộo. - Bệnh tiờu chảy mỡ.
- Rối loạn tụy tạng.
- Trẻ sinh thiếu thỏng và trẻ sơ sinh trọng lượng lỳc sinh thấp. - Bệnh về mỏu di truyền.
- Bệnh xơ húa tạo nang.
Sự dư thừa vitamin E: Vitamin E khi dựng ở liều thụng thường hầu như khụng gõy tỏc dụng phụ. Lượng vitamin E dư thừa khụng được sử dụng được bài tiết ra ngoài cơ thể. Khi lạm dụng vitamin E, dựng liều quỏ cao cú thể gõy buồn nụn, dạ dày bị kớch thớch hoặc bị tiờu chảy, chúng mặt, nứt lưỡi, hoặc gõy viờm thanh quản, những triệu chứng này sẽ mất đi khi ngừng thuốc.
1.2.8. Sự chuyển húa- biến đổi của vitamin E [22]
1.2.8.1. Quỏ trỡnh chuyển húa hấp thu vitamin E
Viatmin E cũng giống như những vitamin tan trong dầu khỏc, được hấp thu cựng với cỏc axit bộo và cỏc triglicerides và tựy thuộc vào sự hiện diện của dầu mỡ trong chế độ ăn uống cũng như tỏc động của cỏc axit mật. Từ ruột non, vitamin E được kết thành cỏc chylomicron để vận chuyển qua hệ bạch huyết, tại đú nú được cho là để tẩy sạch cỏc tế bào như cỏc tế bào hồng cầu. Cựng với vết cũn lại của chylomicron, Vitamin E qua gan sau đú phõn phối vào mụ cơ thể thụng qua lipoprotein tỉ trọng rất thấp (VLDLs), lipoprotein tỉ trọng thấp (LDLs) và lipoprotein tỉ trọng cao (HDLs).
Vitamin E được phõn phối đều hơn cỏc vitamin tan trong dầu khỏc trong mụ cơ thể, với nồng độ cao tỡm thấy trong huyết tương, gan, nóo và mụ mỡ.
Cú hai con đường hấp thu vitamin E ở da là:
- Con đường thứ nhất: Vitamin E qua giỏc mạc, biểu bỡ, lớp nối biểu bỡ. - Con đường thứ hai: Vitamin E đi qua ống tuyến nhờn và giữa nang lụng. Về cơ chế hấp thu và sử dụng hai loại vitamin thiờn nhiờn, tổng hợp trong cơ thể khụng cú gỡ khỏc nhau, nhưng vitamin thiờn nhiờn được sử dụng nhiều hơn khoảng 50% so với loại tổng hợp. Vỡ vậy muốn đạt được hiệu quả mong muốn thỡ khi sử dụng vitamin E tổng hợp phải uống liều lượng tăng lờn gấp 1,4 lần so với vitamin Thiờn nhiờn.
1.2.8.2. Tương tỏc thuốc và chất dinh dưỡng
Vitamin E cú thể gia tăng tỏc động của thuốc chống đụng coumadin, hoặc cỏc chất pha loóng mỏu dạng indandione. Nú cũng cú thể hỗ trợ cho cỏc tỏc động ức chế sự kết tập tiểu cầu của aspirin.
Sắt vụ cơ cú khả năng tiờu hủy vitamin E, nhưng cỏc phức chất hữu cơ khụng cú bất cứ tỏc động nào lờn vitamin E. Ở người thiếu mỏu, thiếu sắt, vitamin E làm giảm tỏc động của sự bổ sung sắt.
Cholestyramine, dầu khoỏng làm giảm sự hấp thu vitamin E.
1.2.8.3 Sự hư hỏng của vitamin E trong quỏ trỡnh chế biến và bảo quản thực phẩm
2/3 vitamin E cú thể mất đi trong quỏ trỡnh sản xuất dầu thực vật thương mại, sản xuất margarine, shortening...
Quỏ trỡnh tự oxy húa chất bộo xảy ra ở thực phẩm sấy hay thực phẩm chiờn rỏm trong dầu mỡ ở nhiệt độ cao làm mất đi vitamin E.
Tổng lượng tocopherol Lượng vitamin E mất đi(%)
Dầu trước khi chiờn 82 1 Dầu sau khi chiờn 73 1
Dầu tỏch từ khoai tõy chiờn (potato chip) Ngay sau khi sản xuất 75
Sau 2 tuần bảo quản ở nhiệt độ phũng 39 48 Sau 1 thỏng bảo quản ở nhiệt độ phũng 22 71 Sau 2 thỏng bảo quản ở nhiệt độ phũng 17 77 Sau 1 thỏng bảo quản ở -120C 28 63 Sau 2 thỏng bảo quản ở -120C 24 68
Dầu tỏch từ khoai tõy chiờn (French fries)
Ngay sau khi sản xuất 78
Sau 1 thỏng bảo quản ở -120C 25 68 Sau 2 thỏng bảo quản ở -120C 20 74
Bảng 1.2.8.3. Độ bền của tocopherol trong quỏ trỡnh chiờn rỏn ở nhiệt độ cao. [22]
Tờn sản phẩm Hàm lượng vitamin E trong sản phẩm(mg/100g)
Dầu ăn tường An 16,8 Bột ngũ cốc Vitamilk 4.5 Bột thịt và rau quả Vinamilk 5.3 Bỏnh Milna (dành cho trẻ em) 4,5 Sữa Frisomum (dỏnh cho phụ nữ
mang thai) 2,5 Sữa Dumex (dành cho phụ nữ mang
thai) 11.3
Sữa Oldac 7,3 Sữa Anlene 0,3 Sữa Fristi 1.2 Sữa dành cho người gầy Appeton 45 Sữa Nestle 11.3 Sữa Milk Max 7 Sữa Enfagrow 10.9
Sữa Meji 6
Bảng 1.2.8.4. Hàm lượng vitamin E trong một số thực phẩm trờn thị trường [22]
1.3. Giới thiệu về phương phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). [2] [3]
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cỏi đầu bằng tiếng Anh của phương phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương phỏp sắc ký lỏng cao ỏp (High Pressure Liquid Chromatography).
Phương phỏp này ra đời từ năm 1967-1968 trờn cơ sở phỏt triển và cải tiến từ phương phỏp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương phỏp HPLC ngày càng phỏt triển và hiện đại húa cao nhờ sự phỏt triển nhanh chúng của ngành chế tạo mỏy phõn tớch. Nú ỏp dụng rất nhiều trong nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc. Và nú hiện là cụng cụ đắc lực trong phõn tớch cỏc thuốc đa thành phần, cho phộp định tớnh và định lượng.
Ưu điểm của HPLC:
- Điều kiện phõn tớch khỏ dễ dàng.
- Dễ dàng thu hồi chất phõn tớch với độ tinh khiết cao. - Độ lặp lại cao.
- Thường khụng phõn hủy mẫu.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương phỏp chia tỏch trong đú pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đó được phõn chia dưới dạng tiểu phõn hoặc một chất lỏng phủ lờn một chất mang rắn, hay một chất mang đó được biến đổi bằng liờn kết húa học với cỏc nhúm chức hữu cơ. Quỏ trỡnh sắc ký lỏng dựa trờn cơ chế hấp thụ, phõn bố, trao đổi Ion hay phõn loại theo kớch cỡ (Rõy phõn tử).
Trong khúa luận này chỳng tụi sử dụng Mỏy sắc ký lỏng cao ỏp hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100
1.3.2. Nguyờn tắc của quỏ trỡnh sắc ký trong cột
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quỏ trỡnh sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thỡ ta cú sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thỡ ta cú Sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thỡ ta cú sắc ký phõn bố hay sắc ký
chiết. Nếu pha tĩnh là Gel thỡ ta cú sắc ký Gel hay Rõy phõn tử. Cựng với pha tĩnh để rửa giải chất phõn tớch ra khỏi cột chỳng ta cần cú một pha động. Như vậy nếu chỳng ta nạp mẫu phõn tớch gồm hỗn hợp chất phõn tớch A, B, C.. Vào cột phõn tớch, kết quả cỏc chất A, B, C.. sẽ được tỏch ra khỏi nhau sau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tỏch sắc ký ở đõy là tổng hợp cỏc tương tỏc F1, F2 và F3.
Chất phõn tớch A + B + C F1 F2
Pha tĩnh F3 Pha động
Tổng của 3 tương tỏc này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiờn khi lực lưu giữ trờn cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại.
Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi 3 lực F1, F2, F3. Trong đú F1 và F2 giữ vai trũ quyết định, cũn F3 là yếu tố ảnh hưởng khụng lớn. Ở đõy F1 là lực giữ chất phõn tớch trờn cột, F2 là lực kộo của pha động đối với chất phõn tớch ra khỏi cột. Như vậy với cỏc chất khỏc nhau thỡ F1 và F2 là khỏc nhau. Kết quả là cỏc chất khỏc nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khỏc nhau và tỏch ra khỏi nhau khi ra khỏi cột.
1.3.3. Phõn loại sắc ký và ứng dụng
Quỏ trỡnh sắc ký dựa trờn sự hấp phụ mạnh, yếu khỏc nhau của pha tĩnh đối với cỏc chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kộo chất tan ra khỏi cột. Theo cơ chế chia tỏch một hỗn hợp phụ thuộc vào tớnh chất động học của chất hấp phụ của sắc ký, người ta phõn ra cỏc loại sau đõy:
- Sắc ký hấp phụ (NP-HPLC và RP-HPLC).
- Sắc ký phõn bố - Sắc ký chiết (LLC).
- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC).
Nhưng thực tế hiờn nay chỳng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phõn tớch mẫu. Sắc ký hấp phụ: quỏ trỡnh sắc ký dựa trờn sự hấp phụ mạnh yếu khỏc nhau của pha tĩnh đối với cỏc chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kộo chất tan ra khỏi cột. Sự tỏch một hỗn hợp phụ thuộc vào tớnh chất động học của chất hấp phụ. Trong loại này cú 02 kiểu hấp phụ:
Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phõn cực, pha động khụng phõn cực.
Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh khụng phõn cực pha động phõn cực.
Loại sắc ký này được ỏp dụng rất rộng rói, thành cụng để tỏch cỏc hỗn hợp cỏc chất cú tớnh chất gần tương tự nhau và thuộc loại khụng phõn cực, phõn cực yếu hay trung bỡnh như cỏc Vitamin, cỏc thuốc hạ nhiệt giảm đau ... Chủ yếu hiện nay chỳng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP).
1.3.4. Cỏc đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ
Kết quả của quỏ trỡnh tỏch cỏc chất được Detector phỏt hiện ghi thành sắc ký đồ. Từ cỏc thụng số của cỏc pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra để đỏnh giỏ một quỏ trỡnh sắc ký. Dưới đõy là một số đại lượng thường dựng trong thực tế và cỏch thay đổi cỏc đại lượng này cú lợi cho quỏ trỡnh phõn tớch sắc ký.
a. Thời gian lưu: Retention time (Rt)
Thời gian lưu của một chất là thời gian tớnh từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đú ra khỏi cột đạt giỏ trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và cỏc chất khỏc nhau thỡ thời gian lưu sẽ khỏc nhau trờn cựng một điều kiện sắc ký đó chọn. Vỡ vậy thời gian lưu là đại lượng để phỏt hiện định tớnh cỏc chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào cỏc yếu tố: - Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
Trong một số trường hợp thời gian lưu cũn phụ thuộc vào pH của pha động. Trong một phộp phõn tớch nếu Rt nhỏ quỏ thỡ sự tỏch kộm, cũn nếu Rt quỏ lớn thỡ peak bị doóng và độ lặp lại của Peak rất kộm, thời gian phõn tớch rất dài đồng thời kộo theo nhiều vấn đề khỏc như hao tốn dung mụi, hoỏ chất, độ chớnh xỏc của phộp phõn tớch kộm. Để thay đổi thời gian lưu chỳng ta dựa vào cỏc yếu tố trờn.
b. Hệ số dung lượng K’
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phõn bố của chất đú trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cõn bằng..
Thường được tớnh theo cụng thức sau: K’ = = − = −1 o R o o R o R t t t t t t t
Hệ số dung lượng K’ phụ thuộc vào bản chất của chất phõn tớch, đặc tớnh của pha tĩnh và pha động. Nếu K’ nhỏ thỡ tR cũng nhỏ và sự tỏch kộm. K’ lớn thỡ pic bị loóng, độ nhạy kộm. Trong thực tế K’ từ 1 đến 5 là tối ưu.
c. Độ chọn lọc α
Độ chọn lọc α cho biết hiệu quả tỏch của hệ thống sắc ký. Khi hai chất A, B cú K’
A và K’
B khỏc nhau thỡ mới cú khả năng tỏch, mức độ tỏch biểu thị ở độ chọn lọc α . α = K’A/K’B (K’ A > K’ B) với α càng khỏc 1 thỡ khả năng tỏch càng rừ ràng d. Số đĩa lý thuyết N
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như một lớp pha tĩnh cú chiều cao là H. Tất nhiờn lớp này cú tớnh chất động, tức là một khu vực của hệ phõn tớch mà trong đú một cõn bằng nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bỡnh của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Vỡ vậy với một điều kiện sắc ký xỏc định thỡ chiều cao H cựng hằng định đối với một chất phõn tớch và số đĩa lý thuyết của cột cũng xỏc định.
Số đĩa lý thuyết N được tớnh theo cụng thức: N = 2 2 5 , 0 2 16 54 , 5 = = b R R R w t w t t δ
Trong đú: tR là thời gian lưu của chất phõn tớch W0,5 là độ rộng tại điểm ẵ của peak
e. Độ phõn giải R (Resolution)
Độ phõn giải là đại lượng biểu thị độ tỏch của cỏc chất ra khỏi nhau trờn một điều kiện sắc ký đó cho. Trong thực tế nếu cỏc Peak cõn đối thỡ độ phõn giải tối thiểu để 2 Peak tỏch là R =1. Trong phộp định lượng R=1,5 là phự hợp.
Nếu R nhỏ thỡ cỏc Peak chưa tỏch hẳn, việc tớnh toỏn diện tớch Peak sẽ khụng chớnh xỏc.
Nếu R lớn quỏ thỡ thời gian phõn tớch sẽ lõu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kộm. Để khắc phục ta cú thể thay đổi hệ pha động hay dựng chương trỡnh Gradient dung mụi. Tuy nhiờn trong quỏ trỡnh chạy sắc ký dựng chương trỡnh dung mụi thỡ một số pha động cú tỷ lệ thay đổi sẽ kộo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tớch của cỏc Peak ta phõn tớch.
Trong thực tế nờn hạn chế sử dụng chương trỡnh Gradient dung mụi mà chủ yếu là chỳng ta phải tỡm được hệ pha động rửa giải phự hợp, đỏp ứng cỏc yờu cầu trong quỏ trỡnh phõn tớch.
f. Hệ số khụng đối xứng T
Hệ số đối xứng T cho biết mức độ khụng đối xứng của pic trờn sắc đồ thu được. T được tớnh bằng tỷ số độ rộng của hai nửa pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều cao của peak.
T =
a b
Peak dạng đối xứng hỡnh Gaus trờn thực tế khú đạt được, vỡ vậy phải quan tõm đến hệ số khụng đối xứng T, khi T ≤ 2,5 thỡ phộp định lượng được chấp nhận; nếu T > 2,5 thỡ điểm cuối của peak rất khú xỏc định. Vỡ vậy cần thay đổi cỏc điều kiện sắc ký để làm cho peak cõn đối xứng hơn theo cỏch sau:
+ Làm giảm thể tớch chiết, tức là đoạn nối từ cột đến Detecter. + Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lờn. + Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cỏch pha loóng mẫu