3. Đối tượng nghiờn cứu
1.3.7.Tiến hành sắc ký
1.3.7.1. Chuẩn bị dụng cụ và mỏy múc
Mỏy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm mỏy hoạt động tốt cho kết quả phõn tớch cú độ đỳng, độ lặp lại, tuyến tớnh, tỷ lệ dung mụi, tốc đụ dũng, năng lượng đốn... đỳng theo yờu cầu thụng số của mỏy do nhà sản xuất đặt ra.
Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi cú nghi ngờ về khả năng tỏch, và rửa đỳng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký:
Vớ dụ: Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: Rửa bằng MeOH, khụng rửa bằng nước.
Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động cú cỏc loại muối thỡ phải rửa nước trước cho sạch muối, sau đú rửa.
Tỷ lệ ACN hay MeOH: Nước (50: 50) cho sạch hết cỏc chất cũn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột khụng bị mốc khi để lõu. Tuyệt đối tỡnh trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đú để cột một thời gian khụng sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng khụng thể dựng được. Xin lưu ý nếu rửa cột khụng tốt thỡ kết quả chạy sắc ký sẽ khụng thể đỏp ứng được cỏc yờu cầu phõn tớch.
1.3.7.2. Chuẩn bị dung mụi pha động
Cỏc dung mụi dựng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC. Cỏc húa chất dựng phải là loại tinh khiết HPLC.
Pha dung mụi đỳng, chớnh xỏc theo đỳng tỷ lệ đó nờu, để ổn định dung mụi đỳng thời gian theo chuyờn luận đó yờu cầu. Lọc dung mụi qua màng lọc 0.2 - 0.45 μm, Siờu õm đuổi bọt khớ.
1.3.7.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC
Mẫu thử: Xử lý mẫu thử theo đỳng chuyờn luận, qui trỡnh theo nguyờn tắc: Dung mụi hũa tan hoạt chất phải hũa tan trong pha động, trong nhiều trường hợp dựng dung mụi pha động để hũa tan mẫu.
Phải loại bỏ cỏc chất khụng tan trong pha động hoặc khụng rửa giải được bằng cỏch lọc hay chiết…
Phải lọc và ly tõm, lọc mẫu qua màng lọc 0.45 μm.
Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, khụng vượt quỏ khả năng tỏch của cột. Cú thể gõy ra nghẽn cột.
Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn cú thành phần giống như mẫu thử trong cựng dung mụi, riờng về nồng độ cỏc thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra cú thể dựng nồng độ khỏc nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tớnh đó khảo sỏt của từng thành phần.
1.3.7.4. Cỏch đo HPLC
Mỗi mỏy cú cỏch vận hành khỏc nhau tựy thuộc vào hóng sản xuất, phần mềm sắc ký. Tuy nhiờn cỏch vận hành luụn phải theo nguyờn tắc sau:
Chạy mỏy với dung mụi pha động để đuổi hết bọt khớ cú trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột.
Đặt đầy đủ cỏc điều kiện sắc ký như: + Cấu hỡnh mỏy.
+ Tỷ lệ cỏc dung mụi pha động.
+ Bước súng, thành phần mẫu, cỏc thụng số của quỏ trỡnh phõn tớch yờu cầu.
1.3.8. Cỏc phương phỏp xỏc định α-tocopherol [5] [20] [11] [13]
1.3.8.1. Định tớnh [20]
a. Phản ứng màu: Hũa tan khoảng 0,01g Mẫu thử trong 10ml ethanol tuyệt đối, đồng thời thờm 2,0ml axit nitric vừa lắc và đun núng ở khoảng 750C trong 15 phỳt, xuất hiện màu đỏ tươi tới màu da cam.
b. Độ tinh khiết
+ Trosulfat:
-Thử theo JECFA monograph 1-Vol,4, Phương phỏp II - Tiến hành thử với 1g mẫu thử.
- Độ axit: Hũa tan 1g mẫu thử trong 25ml hỗn hợp đồng thể tớch ethanol và ether đó được trung tớnh húa đối với phenolphthalein bằng natri hydroxyd 0,1N, thờn 0,5 ml phenolphthalein và chuẩn độ bằng natri hydroxyd 0,1N tới khi dung dịch duy trỡ màu hồng nhạt sau khi lắc 30 giõy. Lượng dung dịch natri hydroxyd 0,1N tiờu thụ khụng được nhiều hơn 1,0ml.
+ Chỡ:
-Thử theo JECFA monograph 1-Vol,4
- Sử dụng kỹ thuật hấp thụ nguyờn tử thớch hợp với hàm lượng quy định để xỏc định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương phỏp chuẩn bị mẫu dựa theo nguyờn tắc của phương phỏp mụ tả trong JECFA monograph 1-Vol.4 phần cỏc phương phỏp phõn tớch cụng cụ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.3.8.2. Định lượng
1.3.8.2.1 Phương phỏp sắc ký lỏng a. Thuốc thử và dung dịch
Dung dịch chuẩn nội: Chuẩn bị dung dịch trong n-hexan chứa 3mg hexadecyl hexadecanoat, cõn chớnh xỏc trong 1ml.
Dung dịch chuẩn: Hũa tan khoảng 30mg α-tocopherol chuẩn đối chiếu USP hay tương đương, cõn chớnh xỏc trong 10,0ml dung dịch chuẩn nội.
b. Hệ thống sắc ký:
Dựng mỏy sắc ký khớ cú detector ion húa ngọn lửa và hệ tiờn mẫu qua ống thủy tinh hoặc tiờm mẫu vào thẳng cột. Trong điều kiện điển hỡnh, thiết bị gồm cột thủy tinh boro-silicat 2mmì4mm nhồi diatomit 80-120
mesh cho sắc ký đó silan húa, rửa acid-base và tẩm 2% methylpolysioxan. Cột được duy trỡ đẳng nhiệt trong khoảng 2400C và 2600C, buồng tiờm khoảng 2900C, và detector khoảng 3000C. Điều chỉnh tốc độ khớ mang khụ để thu được peak hexadecyl hexadecaoat ở khoảng 18 đến 20 phỳt sau khi bơm mẫu khi dựng cột 2%, hoặc 30 tới 32 phỳt khi dựng cột 5% (chỳ ý xử lý và luyện cột nếu cần).
c. Tớnh phự hợp của hệ thống
Chạy sắc ký một số vừa đủ mẫu tiờm hỗn hợp trong n-hexan của 1mg/ml mỗi chất α-tocopherol chuẩn đối chiếu và α-tocopherol Acetat chuẩn đối chiếu, như chỉ dẫn trong phần chuẩn húa, để đảm bảo rằng độ phõn giải, R, khụng được nhỏ hơn 1,0.
d. chuẩn húa
Chạy sắc ký liờn tiếp những lượng 2 tới 5 μl dung dịch chuẩn tới khi hệ số đỏp ứng tương đối F khụng đổi (tức là thay đổi trong khoảng 2%) đối với ba lần tiờm lặp lại liờn tiếp. Nếu dựng tớch phõn, điều chỉnh thiết bị để thu được ớt nhất peak hexadecyl hexadecaoat nằm trong khoảng tối đa là 70% thang ghi. Đo diện tớch cỏc peak chớnh xuất hiện tại thời gian lưu tương đối khoảng 0.51 (α-tocopherol) và 1.00 (hexadecyl hexadecaoat) và ghi giỏ trị lần lượt là Ac và Al. Tớnh hệ số đỏp ứng tương đối F theo cụng thức:
F = (Ac/Al) ì (Cl/CC)
Trong đú: Cl và CC lần lượt là nồng độ chớnh xỏc, tớnh bằng mg/ml của hexadecyl hexadecanoat và α- tocopherol chuẩn đối chiếu USP trong dung dịch chuẩn.
e. Tến hành
Bơm một thể tớch thớch hợp (2 tới 5 μl) dung dịch thử vào hệ thống sắc ký và ghi sắc đồ. Ghi diện tớch peak chớnh xuất hiện tại thời gian lưu tương đối khoảng 0.51 (α-tocopherol) và 1.00 (hexadecyl hexadecanoat), và ghi giỏ trị lần lượt là at và al.
Tớnh khối lượng, mg, của dl-α-tocopherol trong mẫu thử theo cụng thức:
m= (10Cl/F)ì(at/al)
1.3.8.3. Định lượng α-tocopherol bằng phương phỏp sắc ký lỏng
hiệu năng cao HPLC[5] [11] [13]
1.3.8.3.1. Nguyờn tắc
α- tocopherol trong dung dịch mẫu thớch hợp được xỏc định bằng HPLC để tỏch sau đú phỏt hiện bằng đo quang (dải UV) hoặc tốt nhất là huỳnh quang.
Trong phần lớn cỏc trường hợp, mẫu thử cần được xà phũng húa, sau đú được chiết tỏch bằng phương phỏp thớch hợp. Việc nhận biết được dựa vào thời gian lưu và được định lượng bằng phương phỏp ngoại chuẩn sử dụng cỏc diện tớch peak hoặc chiều cao peak. Cỏc phương phỏp nội chuẩn cú thể được sử dụng nếu cỏc phộp thử độ thu hồi cho thấy cú cựng tớnh năng của chất nội chuẩn trong quỏ trỡnh phõn tớch.
1.3.8.3.2. Thuốc thử
1. Metanol
2. Etanol tuyệt đối φ(C2H5OH) = 100% thể tớch. 3. Etanol, φ(C2H5OH) = 96%
5. Dung dịch KOH để xà phũng húa, nồng độ thớch hợp. Vớ dụ (KOH)= 50g/100ml hoặc 60g/100ml hoặc cỏc dung dịch cồn, vớ dụ: 28g KOH trong 100ml hỗn hợp etanol/nước (9+1) (phần thể tớch).
6. Chất chống oxy húa: Như axit ascorbic (AA), natri ascorbat, pyrogallol, natri sulfua, hydroquinone hoặc hydroxytoluen đó butylat húa (BHT).
7. Dung mụi và cỏc dung mụi chiết, như ete dietyl (khụng chứa peroxit), diclo metan, dầu nhẹ (dải sụi từ 400C đến 600C), n-hexan, etylaxetat hoặc cỏc hỗn hợp thớch hợp.
8. Pha động của HPLC: Cỏc hỗn hợp thớch hợp được biểu thị theo thể tớch, như: 1,4 dioxan 3% hoặc 2-propanol 0,5% , metyl tert-butyl ete 3% trong n-hexan hoặc n-heptan đối với sắc ký pha thuận (NP) hoặc 1% đến 10% nước trong methanol đối với sắc ký pha đảo (RP).
9. Chất chuẩn: α-tocopherol cú thể cú được từ cỏc nhà cung cấp khỏc nhau. Độ tinh khiết của cỏc chất chuẩn tocopherol dao động từ 90% đến 100%. Do đú cần phải xỏc định nồng độ của dung dịch hiệu chuẩn bằng đo phổ UV. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Yờu cầu đối với chất chuẩn: α-tocopherol M(C29H50O2) = 430,7 g/mol, biết trước khối lượng ớt nhất là 95%, α-tocopherol axetat M(C31H52O3)= 472,7 g/mol cũng cú thể được dựng làm chất chuẩn sau khi xà phũng húa.
9.1 Dung dịch gốc α-tocopherol
Hũa tan một lượng chất chuẩn α-tocopherol được cõn chớnh xỏc đến miligam, như khoảng 10mg trong một thể tớch xỏc định, như trong 100ml dung mụi ( n-hexan đối với hệ thống NP hoặc methanol đối với hệ thống RP).
9.2 Phộp thử về nồng độ và độ tinh khiết
Đo độ hấp thụ của dung dịch gốc ở cỏc bước súng thớch hợp bằng mỏy đo phổ UV. Nếu sử dụng dung mụi n-hexan thỡ dựng pipet lấy 10ml dung dịch gốc cho vào bỡnh đỏy trũn bằng thủy tinh nõu và loại bỏ dung mụi trờn mỏy cụ quay, dưới ỏp suất giảm ở nhiệt độ khụmg quỏ 500C. Sau khi hồi lại ỏp suất khớ quyển bằng nitơ thỡ lấy bỡnh ra và hũa tan lượng cặn trong 10ml metanol bằng cỏch lắc bỡnh. Lấy dung dịch này để đo phổ.
Tớnh nồng độ khối lượng của vitamin E, ρ, của α-tocopherol bằng microgram trờn mililit theo cụng thức:
Ρ = 1% 1 4 10 cm E Aì Trong đú:
A là giỏ trị độ hấp thụ của α-tocopherol trong dung dịch gốc tương ứng.
% 1 1cm
E là giỏ trị của α-tocopherol được xỏc định theo bảng:
Chất Bước súng (methanol) 1% 1cm E α-tocopherol 292nm 76 β-tocopherol 296nm 89 Γ-tocopherol 298nm 91 δ-tocopherol 298nm 87 Bảng 1.3.7.3.2 cỏc vớ dụ về giỏ trị 1% 1cm E
Ngoài giỏ trị α-tocopherol thu được ở bước súng 292nm, thỡ cần đo độ hấp thụ ở bước súng 255nm (nhỏ nhất). Giỏ trị 1%
1cm
E đo được ở bước súng này cần nằm trong dải từ 6 đến 8, nếu khụng đạt nghĩa là đó bị biến chất.
10. Dung dịch chuẩn α-tocopherol
Dựng pipet lấy 10ml dung dịch gốc α-tocopherol cho vào bỡnh định mức một vạch 100ml và pha loóng đến vạch bằng dung mụi thớch hợp (vớ dụ: n-hexan cho NP và methanol cho RP). Dung dịch chuẩn cần cú nồng độ
1μg/ml đến 10μg/ml α-tocopherol. Nếu sử dụng detector UV để kiểm soỏt sắc ký thỡ cần sử dụng dung dịch đậm đặc hơn.
Dung dịch chuẩn bị phải được bảo quản trỏnh ỏnh sỏng và để ở nhiệt độ nhỏ hơn 40C và cần được kiểm tra định kỳ.
1.3.8.3.3. Thiết bị và dụng cụ:
Sử dụng cỏc thiết bị, dụng cụ của phũng thử nghiệm thụng thường và cụ thể như sau:
- Mỏy đo phổ UV: Cú thể đo độ hấp thụ ở cỏc bước súng xỏc định, cú cỏc cuvet xỏc định.
- Bộ cụ quay: bằng nồi cỏch thủy và bộ phận khử chõn khụng.
- Hệ thống HPLC: Gồm cú bơm, bộ phận bơm mẫu, detector huỳnh quang cú bước súng kớch thớch 295nm và bước súng phỏt xạ 330nm và hệ thống đỏnh giỏ như mỏy tớch phõn.
Cú thể sử dụng detector UV. Bước súng được cài đặt ở 292nm và trong trường hợp này dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu cần phải đậm đặc hơn. Ngoài ra, khả năng phỏt hiện cỏc hợp chất gõy nhiễu sẽ tăng.
- Cột HPLC :
Cột phõn tớch pha thuận: Đường kớnh từ 4,0 mm đến 4,6mm và dài từ 100mm đến 250mm, được nhồi đầy silica cỡ hạt 5μm.
Cú thể sử dụng cỡ hạt và kớch thước cột khỏc với quy định trong TCVN 8276: 2010 nhưng yờu cầu cỏc thụng số tỏch cần phải phự hợp với vật liệu để đảm bảo cho kết quả tương đương.
Cỏc tiờu chớ về hiệu năng đối với cỏc cột phõn tớch thớch hợp là độ phõn giải đường nền của chất phõn tớch cú liờn quan.
Cỏc vật liệu nhồi cột silica thớch hợp cú sẵn từ hóng Lichrosorb đ602), Spherisorbđ Si2), Hypersil đSi2) và Lichrospherđ 100 DIOL2).
Cũng cú thể sử dụng cột pha đảo phõn tớch, vớ dụ: C18, cú cỡ hạt 5μm, đường kớnh 4,0 mm đến 4,6mm, dài 100mm đến 250mm. Cỏc vật liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhồi cột pha đảo phõn tớch thớch hợp là Spherisorbđ ODS2) và Hypersil đ ODS2).
- Thiết bị lọc: Cỏc thiết bị lọc cỡ nhỏ và cỡ lớn để lọc pha động HPLC và cỏc dung dịch mẫu tương ứng, vớ dụ như cỡ lỗ 0,45μm là thớch hợp.
- Bộ lọc tỏch pha
1.3.8.3.4. Cỏch tiến hành 1.3.8.3.4.1. Chuẩn bị mẫu:
Đồng húa mẫu thử. Nghiền mẫu bằng dụng cụ thớch hợp và trộn lại, cần thực hiện cỏc biện phỏp như làm lạnh sơ bộ để trỏnh mẫu bị tiếp xỳc với nhiệt độ cao trong thời gian dài.
1.2.8.3.4.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
a. Cỏc mẫu dầu và mỡ cú hàm lượng nước thấp cú chứa cỏc α- tocopherol chưa este húa.
- Mẫu dầu và mỡ (cú hàm lượng nước thấp)
Quy trỡnh này chỉ cú thể ỏp dụng cho cỏc mẫu cú chứa cỏc α- tocopherol chưa este húa.
Tiến hành: Cõn 2g mẫu thử chớnh xỏc đến 1mg cho vào bỡnh định mức một vạch 25ml. Thờm n-hexan hoặc dung mụi thớch hợp khỏc và hũa tan phần mẫu thử bằng cỏch xoay bỡnh. Siờu õm dung dịch cú thể hỗ trợ cho việc hũa tan. Thờm cựng loại dung mụi đến vạch. Dung dịch mẩu thử này chỉ được sử dụng cho cỏc hệ thống NP. Cú thể cần phải pha loóng dung dịch này trước khi đo sắc ký hoặc sử dụng một lượng mẫu nhỏ hơn.
- Margarin, bơ
Cần phải tỏch chất bộo của margarine và của bơ trước khi pha loóng mẫu. Cú thể thực hiện bằng cỏch : Vớ dụ: Trộn mẫu với natri sulfat khan, thờm n-hexan và xử lý hỗn hợp trong thiết bị siờu õm. Lọc bỏ chất rắn và rửa ớt nhất 2 lần bằng n-hexan. Loại bỏ dung mụi bằng bộ cụ quay và ỏp
suất giảm, hũa tan cặn trong một thể tớch xỏc định của n-hexan và định lượng bằng HPLC pha chuẩn.
b. Cỏc loại mẫu khỏc:
Bước 1:. Xà phũng húa
Xà phũng húa từ 2g đến 10g mẫu thử bằng hồi lưu dưới dũng nitơ sử dụng cỏc lượng thớch hợp etanol hoặc methanol, nước và chất chống oxy húa như axit ascorbic, hydroquinone, pyrogalol hoặc BHT và dung dịch kali hydroxit. Thờm cồn và cỏc chất chống oxy húa vào mẫu trước khi bổ sung dung dịch kali hydroxit.
Khối lượng mẫu Cồn Chất chống oxy húa Kali hydroxit
2g đến 5g 50ml metanol 0,25g AA 5ml dung dịch 50g/100ml 5g đến 10g 100ml etanol 1,0g AA + 0,04g Na2S 20ml dung dịch 60g/100ml 10g 150ml etanol 1.0g AA 50ml dung dịch 60g/100ml Bảng 1.2.8.3.4.2 : Cỏc vớ dụ về tỷ lệ thớch hợp của thuốc thử
Thời gian xà phũng húa trong khoảng từ 15 phỳt đến 40 phỳt ở nhiệt độ từ 800C đến 1000C. Nếu sau khi xà phũng húa và làm nguội, mà dầu hoặc mỡ cú trờn bề mặt của hỗn hợp xà phũng húa thỡ cần phải thờm một lượng dư dung dịch kali hydroxit và thời gian xà phũng húa phải kộo dài.
Bước 2: Chiết
Để trỏnh tạo nhũ tương, cần bổ sung một lượng nước vào dung dịch mẫu đó xà phũng húa sao cho tỷ lệ của cồn và nước cú trong dung dịch tạo thành là 1:1. Chiết α-tocopherol bằng dung mụi thớch hợp. Lặp lại quy trỡnh chiết khoảng 3 đến 4 lần với cỏc thể tớch từ 50ml đến 150ml. Rửa cỏc phần chiết thu được bằng nước (từ 2 đến 4 lần dựng 50 đến 150ml) đến trung
tớnh. Việc chiết cú thể được thực hiện bằng kỹ thuật lỏng/lỏng cú hỗ trợ pha rắn khi hàm lượng α-tocopherol khụng quỏ thấp.
Bước 3: Làm bay hơi
Làm bay hơi dung dịch chiết bằng bộ cụ quay. Loại bỏ hết nước bằng cỏch làm khụ trờn natri sulfat hoặc được chưng cất đẳng phớ với etanol tuyệt đối hoặc toluene. Cú thể sử dụng cỏc kỹ thuật tương đương khỏc như giấy lọc tỏch pha để loại bỏ cỏc vết nước, với điều kiện đó được chứng minh là khụng ảnh hưởng đến kết quả.
Bước 4: Pha loóng.
Hũa tan cặn pha động hoặc dung mụi HPLC tương đương khỏc đến