3. Đối tượng nghiờn cứu
2.2. Phương phỏp phõn tớch α-tocophero
Mẫu thử là mẫu dầu gấc (thuộc mẫu dầu cú hàm lượng nước thấp): dựng pipet loại 5ml hỳt chớnh xỏc 5ml dầu gấc cho vào bỡnh định mức 50ml, thờm dung mụi n-hexan, siờu õm trong 5-10 phỳt, định mức tới vạch bằng n-hexan.
Đối với mẫu bơ và xốt trứng gà tươi thỡ cõn chớnh xỏc 2g mẫu thử cho vào cốc thủy tinh, trộn mẫu với natri sunfat khan, thờn n-hexan và xử lý hỗn hợp trong thiết bị siờu õm (khoảng 5-10 phỳt), lọc bỏ chất rắn và rửa bằng dung mụi ớt nhất hai lần bằng n-hexan, loại bỏ dung mụi bằng bộ cụ quay và ỏp suất giảm, hũa tan cặn bằng n-hexan và cho vào bỡnh định mức 25ml, định mức tới vạch bằng n-hexan.
Phõn tớch α-tocopherol trong cỏc mẫu thực phẩm: tinh dầu gấc,bơ, xốt trứng gà tươi bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao theo Tiờu chuẩn Quốc Gia 8276 : 2010.
CHƯƠNG III. KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 3.1. Thiết bị ,dụng cụ và húa chất
3.1.1. Thiết bị, Dụng cụ
Sử dụng cỏc thiết bị và dụng cụ của phũng thớ nghiệm thụng thường và cụ thể như sau: 3.1.1.1. Thiết bị: - Mỏy đo phổ UV - Bộ cụ quay - Hệ thống HPLC - Cột HPLC - Thiết bị lọc - Mỏy siờu õm.
- Cõn phõn tớch. - Bộ lọc tỏch pha.
3.1.1.2. Dụng cụ
- Bỡnh tam giỏc: 2 lọ 100ml
- Phễu lọc thủy tinh cú chứa lớp vật liệu lọc: 2 cỏi - Bỡnh định mức: 10ml, 25ml, 50ml, 100ml. - Pipet cỏc loại
- Giấy lọc
- Cốc thủy tinh 100ml. - Đũa thủy tinh, thỡa inox.
3.1.2. Húa chất
- n-hexan (HPLC, Merk)
- Natri sunfat khan ( HPLC, Merk)
- Chất chuẩn (±)-α-tocopherol-synthetic,≥96% (HPLC). - 1,4 Đioxan
- Nước cất 1 lần.
3.2. Kỹ thuật thực nghiệm
3.2.1. Sơ đồ xử lý chất chuẩn và mẫu
Hỡnh 3.2.1.1. Sơ đồ xử lý chất chuẩn
- Mẫu dầu gấc
Hỡnh 3.2.1.2. Sơ đồ xử lý mẫu dầu gấc
- Mẫu bơ và xốt trứng gà tươi
Chất chuẩn α-tocopherol 96% (HPLC) Cõn chớnh xỏc 10mg Định mức 100ml bằng pha động Siờu õm trong 5 phỳt
Pha dóy chuẩn Dung dịch
Bơm qua đầu lọc
Chất chuẩn bơm vào HPLC
Mẫu dầu gấc Hỳt chớnh xỏc 5ml mẫu Định mức tới vạch 50ml bằng pha động
Siờu õm trong 5 phỳt Dung dịch
Bơm qua màng lọc
Mẫu bơm vào HPLC
Hỡnh 3.2.1.3. Sơ đồ xử lý mẫu bơ và xốt trứng gà tươi
3.2.2. Tiến hành
3.2.2.1. Chất chuẩn gốc α-tocopherol ≥96%
Bảo quản: Chuẩn gốc bảo quản tại 20C đến 80C, hạn sử dụng dựa
theo khuyến cỏo của nhà sản xuất. Tất cả cỏc dung dịch chuẩn phải được chuẩn bị trước khi phõn tớch.
-Dung dịch chuẩn gốc 100 μg/ml: Cõn 10mg (±0.1mg) chất chuẩn α- tocopherol≥ 96% (M(C29H50O2)=430,7 g/mol) vào bỡnh định mức 100 ml, hũa tan và định mức đến vạch bằng n-hexan.
-Dung dịch chuẩn 10 μg/ml: Hỳt chớnh xỏc 1ml dung dịch chuẩn gốc 100 μg/ml vào bỡnh 10ml. Định mức đến vạch bằng dung dịch pha động.
Mẫu bơ và xốt trứng gà tươi
Cõn chớnh xỏc 2g cỏc loại mẫu
Trộn mẫu với natri sunfat khan Thờm n-hexan Siờu õn trong 5 phỳt Lọc bỏ chất rắn, rữa
Loại bỏ dung mụi bằng bộ cụ quay
Hũa tan phần cặn, định mức 25ml
Dung dịch Bơm qua đầu lọc
Mẫu bơm vào HPLC
- Dung dịch chuẩn 20 μg/ml: hỳt chớnh xỏc 2 ml dung dịch chuẩn gốc 100 μg/ml vào bỡnh định mức 10ml định mức đến vạch bằng dung dịch pha động.
- Dung dịch chuẩn 45 μg/ml: hỳt chớnh xỏc 4.5ml dung dịch chuẩn 100 μg/ml vào bỡnh định mức 10ml định mức đến vạch bằng dung dịch pha động.
Lắc đều và siờu õm 5 phỳt. Lọc dung dịch thu được qua màng lọc dung mụi 13mm - 0,45μm. Thu dịch lọc vào vial dựng cho HPLC, bơm vào mỏy. Cú ghi cỏc ký hiệu của mỗi mẫu chuẩn.
3.2.2.2 Mẫu phõn tớch
Để xỏc định hàm lượng α-tocopherol trong cỏc mẫu dầu gấc,bơ và xốt trứng gà tươi ta cần phải xử lý mẫu và bơm vào mỏy HPLC.
Xử lý mẫu sơ bộ:
- Đối với mẫu tinh dầu gấc: lắc kỹ, dựng pipet loại 5ml lấy 5ml mẫu cho vào bỡnh định mức 50ml thờn 1 lượng n-hexan, siờu õm trong 5 phỳt và định mức đến vạch bằng dung mụi pha động.
- Cỏc mẫu Bơ, xốt trứng gà tươi. Mẫu bơ: Cõn 2,0006g mẫu.
Mẫu xốt trứng gà tươi: cõn 2,0003g mẫu.
Cả hai lượng mẫu đều được trộn với lượng dư natri sunfat khan (nhằm tỏch chất bộo của bơ và xốt trứng gà tươi trước khi pha loảng mẫu), thờn n-hexan và xử lý hỗn hợp trong thiết bị siờu õm, lọc bỏ chất rắn và rữa ớt nhất hai lần bằng n-hexan, loại bỏ dung mụi bằng bộ cụ quay và ỏp suất giảm đến gần khụ (cũn gần 1ml). ở nhiệt độ 79.990C và tốc độ 115 vũng/phỳt. Hũa tan phần cũn lại trong 2 ml n-hexan và cho vào bỡnh định mức 25ml, định mức tới vạch bằng dung mụi pha động thu được cỏc mẫu:
+ Mẫu 1: mẫu xốt trứng gà tươi + Mẫu 2: mẫu bơ
- Định mức chớnh xỏc cỏc mẫu tới vạch bằng n-hexanl (lắc đều và siờu õm trong 5 phỳt). Lọc dung dịch thu được qua màng lọc dung mụi 13mm - 0,45μm. Thu dịch lọc vào vial dựng cho HPLC, bơm vào mỏy HPLC. Cú ghi cỏc ký hiệu của mỗi mẫu.
3.3. Tiến hành trờn mỏy sắc ký HPLC3.3.1. Điều kiện sắc ký 3.3.1. Điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký: cột sắc ký pha thuận NP (Lichrosorbđ Si 60,5μm). - Tốc độ dũng: 0.5 ml/phỳt.
- Pha động: 1,4-dioxan/n-hexan: 1,2/98,8) - Nhiệt độ lũ cột: 300C
- Phỏt hiện: Đo huỳnh quang, bước súng Kớch thớch: 295nm, bước súng phỏt xạ: 330nm.
(Ghi chỳ: tốc độ dũng và tỉ lệ pha động cú thể thay đổi tuỳ cột sử dụng).
3.3.2. Điều kiện Detectơ
Sử dụng Detectơ huỳnh quang ở bước súng 295 nm. Loại detectơ này cho phộp ghi phổ hấp thụ huỳnh quang của α-tocopherol được tỏch ra trờn sắc ký đồ. Với sự trợ giỳp của mỏy tớnh, cỏc dữ liệu phổ này được lưu trữ và sau đú đem so sỏnh với phổ hấp thụ của cỏc chất chuẩn, nhờ đú cho phộp khẳng định được phần nào cấu trỳc của α-tocopherol và đỏnh giỏ được độ sạch của peak.
3.4. Khảo sỏt đỏnh giỏ phương phỏp3.4.1. Khảo sỏt độ lặp lai 3.4.1. Khảo sỏt độ lặp lai
Độ lặp lại được dựng để đỏnh giỏ định lượng độ phõn tỏn của cỏc kết quả. Đại lượng này đặc trưng cho độ gần về giỏ trị trung bỡnh của hai hay nhiều phộp đo nhận được trong những điều kiện giống nhau.
Đỏnh giỏ độ lặp dựa trờn độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
- Tớnh giỏ trị trung bỡnh hàm lượng α-tocopherol trong mẫu: Xtb= ∑ = n i x n 1 1 - Độ lệch chuẩn: S= 1 ) ( 1 2 − − ∑ = n x x n i tb i
- Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) =
tb x Sì100
Trong đú: Xi là nồng độ α-tocopherol ở lần chạy thứ i Xtb là nồng độ trung bỡnh của n lần chạy n là số lần chạy lặp lại
3.4.2. Đỏnh giỏ hiệu suất thu hồi của phương phỏp
Để đỏnh giỏ hiệu suất thu hồi của phương phỏp tiến hành phõn tớch mẫu theo quy trỡnh thờn với phương phỏp thờm chuẩn.
Mẫu 1: mẫu bơ khụng cho thờm chuẩn. Mẫu 2: mẫu bơ thờm chuẩn.
Hiệu suất thu hồi được xỏc định theo cụng thức sau: %H = + − ì100% so m m s C C C Trong đú:
%H là hiệu suất thu hồi.
Cs+m là nồng độ tổng chuẩn thờm vào và mẫu thực cú đo được. Cm là nồng độ mẫu thực đo được.
4.1. Khảo sỏt cỏc yếu tố ảnh hưởng đến phộp định lượng α-tocopherol bằng HPLC bằng HPLC
4.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ cột tỏch
Nhiệt độ cột cỏch ảnh hưởng đến quỏ trỡnh phõn tớch vỡ nú ảnh hưởng đến sự chuyển động nhiệt của cỏc phần tử trong mẫu và sự co gión của cột nhất là đối với khớ hậu khắc nghiệt của Nghệ An, nhiệt độ ban ngày và ban đờm cú sự chờnh lệch lớn.
Hiện nay cỏc mỏy sắc ký hiện đại cú trang bị thiết bị điều nhiệt, ta cú thể cài đặt cựng một nhiệt độ cho mỏy trong suốt thời gian phõn tớch. Vỡ vậy đối với thiết bị HPLC hiện đại thỡ kết quả phõn tớch ớt bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ.
Trong luận văn này chỳng tụi khảo sỏt tại cỏc nhiệt độ thay đổi như sau:25, 30, 35 0C, cũn cỏc điều kiện khỏc được giữ nguyờn:
- Thể tớch bơm mẫu: 20μl. - Flow: 1 ml/mim.
- Pha động: 1,4-dioxan/n-hexan: 3/97. Kết quả thu được trỡnh bày ở bảng [4.1.1]
TT Nhiệt độ cột (oC) Thời gian lưu (phỳt) Áp suất (bar)
1 25 1.99 93
2 30 2,025 93
3 35 2.106 77
Bảng 4.1.1. Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ đến phộp định lượng α-tocopherol bằng HPLC
Trong cỏc thớ nghiệm của luận văn này trờn hệ thống HPLC chỳng tụi đặt nhiệt độ là 300C.
4.1.2 Ảnh hưởng của thề tớch bơm mẫu
Thể tớch bơm mẫu ảnh hưởng rất lớn đến khả năng bắt tớn hiệu, thời gian lưu của mẫu và vỡ vậy sẽ ảnh hưởng đến chiều cao của peak tương
ứng. Ở đõy chỳng tụi khảo sỏt thể tớch bơm mẫu từ 3μl đến 10μl, cũn cỏc điều kiện khỏc được giữ nguyờn:
- Áp suất: 24 bar. - Flow: 0,5 ml/mim. - Nhiệt dộ cột: 300C.
- Pha động: 1,4-dioxan/n-hexan: 2/98.
Kết quả thu được trỡnh bày ở bảng [4.1.2] và sắc đồ mục [4.4.2.1]
TT Vbơm (μl) Rt (phỳt) Chiều cao peak
Tớnh đối xứng của peak
1 0,3 4,675 27 Peak cao, cõn đối 2 0,7 3,281 60,2 Peak cao, cõn đối 3 1 2,343 64 Peak nhọn, cõn đối 4 1,3 1,824 69 Peak khụng cõn đối 5 3 4,675 34 Peak nhọn, cõn đối 6 5 2,354 45 Peak nhọn, cõn đối 7 10 4,785 90,7 Peak nhọn, cõn đối
Bảng 4.1.2. Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của thể tớch bơm mẫu đến phộp định lượng α-tocopherol bằng HPLC
Trong cỏc thớ nghiệm của luận văn này trờn hệ thống HPLC chỳng tụi đặt thể tớch bơm là 10μl.
4.1.3. Ảnh hưởng của tốc độ dũng
Tốc độ dũng ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu của mẫu, vỡ vậy sẽ ảnh hưởng đến chiều cao của peak tương ứng. Ở đõy chỳng tụi khảo sỏt tốc độ dũng thay đổi từ 0.3 ml/phỳt đến 1.3 ml/phỳt, cũn cỏc điều kiện khỏc giữ nguyờn:
- Vmẫu: 10μl.
- Nhiệt dộ cột: 300C.
- Pha động: 1,4-dioxan/n-hexan: 2/98.
(ml/min) (phỳt) peak peak peak
1 0,3 7,732 2321 75,5 Peak cao, cõn đối 2 0,5 5,153 795,6 76,2 Peak nhọn,cao, cõn đối 3 0,7 3,281 1002,5 55,7 Peak hơi lệch 4 1 2,343 751,5 62,5 Peak nhọn, cõn đối 5 1,3 1,822 633 73,6 Peak nhọn, cõn đối
Bảng 4.1.3. Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của tốc độ dũng đến phộp định lượng α-tocopherol bằng HPLC
Như vậy tốc độ dũng càng lớn thỡ thời gian lưu càng nhỏ.
Từ cỏc kết quả trờn chỳng tụi chọn tốc độ dũng là 0,5 ml/phỳt để tiến hành cỏc thớ nghiệm khỏc.
4.1.4. Ảnh hưởng của thành phần dung mụi pha động
Thành phần dung mụi pha động ảnh hưởng rất lớn đến kết quả phõn tớch. Nếu như tỷ lệ pha động này khụng được tuõn thủ nghiờm ngặt thỡ sẽ cú tỏc dụng khụng tốt tới sự đối xứng của peak và ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu.
Trong luận văn này chỳng tụi khảo sỏt thành phần pha động 1,4- dioxan/n-hexan thay đổi như sau 0,2/99,8; 0,5/99,5; 1,5/98,5; 2/98; 2,5/97,5; 5/95; 1/99, cũn cỏc điều kiện khỏc được giữ nguyờn:
- Flow: 0,5 ml/mim. - Nhiệt dộ cột: 300C. - Vmẫu: 10μl.
Kết quả thu được trỡnh bày ở bảng [4.1.4] và sắc đồ mục [4.4.2.3]
TT Tỉ lệ pha động Rt (phỳt) Diện tớch peak Chiều cao peak Tớnh đối xứng của peak 1 0,2/99,8 5,162 1153,4 54,9 Peak cõn đối, đẹp 2 0,5/99,5 5,087 925,3 46 Peak xấu, hỏng 3 1,5/98,5 4,745 1049,6 55,9 Peak nhọn, đẹp 4 2/98 4,641 1259,4 63.1 Peak nhọn, đẹp 5 2,5/97,5 4,524 1342,7 55,5 Peak nhọn, đẹp 6 5/96 1,999 983,4 33 Peak xấu, dớnh peak 7 1/99 4,894 959,7 47.5 Peak cõn đối
8 1,2/98.8 5,155 1661,65 159,5 Peak nhọn,cõn đối, đẹp
Bảng 4.1.4. Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của tỉ lệ pha dộng đến phộp định lượng α-tocopherol bằng HPLC
Từ cỏc kết quả trờn chỳng tụi chọn tỉ lệ pha động 1,4-dioxan/n- hexan: 1,2/98,8 để tiến hành cỏc thớ nghiệm khỏc.
4.1.5. Ảnh hưởng của phương phỏp xử lý mẫu
Mỗi giai đoạn xử lý mẫu đều ảnh hưởng đến kết quả phõn tớch. Nhất là đối với quy trỡnh xử lớ mẫu phức tạp như phương phỏp HPLC. Trong quy trỡnh xử lớ mẫu nếu khụng tuõn thủ cỏc bước trong quy trỡnh chuẩn sẽ gõy ra sai số lớn cho kết quả phõn tớch. Việc thờm dung mụi vào để thực hiện quỏ trỡnh chiết cũng rất quan trọng nhất là tỷ lệ của dung mụi và thứ tự đem dung mụi vào mẫu.
4.2. Xõy dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của diện tớch peak vào nồng độ vào nồng độ
Dóy chuẩn α-tocopherol được khảo sỏt cú nồng độ như sau: 10ppm; 20ppm; 45ppm. Phõn tớch cỏc chuẩn với cỏc điều kiờn tối ưu đó khảo sỏt:
- Cột sắc ký: cột sắc ký pha thuận NP-18. - Tốc độ dũng: 0.5 ml/phỳt.
- Pha động: 1,4-dioxan/n-hexan: 1,2/98,8) - Nhiệt độ lũ cột: 300C
- Phỏt hiện: Đo huỳnh quang, bước súng Kớch thớch: 295nm, bước súng phỏt xạ: 330nm.
+ Tiến hành chạy mỏy HPLC thu được kết quả như sau:
Hỡnh 4.2.2. Sắc đồ mẫu chuẩn α-tocopherol cú nồng độ 20ppm
+ Từ kết quả xỏc định phương trỡnh hồi quy tuyến tớnh dựa vào diện tớch cỏc peak.
Nồng độ
chuần Diện tic pic m b R
2
10ppm 874,76288
77,59163 59,09645 0,99936 20ppm 1661,65234
45ppm 3411,18286
Bảng 4.2.1. Diện tớch pic của α-tocopherol tương ứng với từng nồng độ chuẩn
+ Sử dụng chương trỡnh Microsoft Excel để xõy dựng đường chuẩn, ta cú phương trỡnh đường chuẩn xỏc định hàm lượng α-tocopherol như sau:
Phương trỡnh hồi quy của đường chuẩn theo diện tớch peak cú dạng: y = mx +b x là nồng độ, y diện tớch pic
m = 77,59163 b = 59,09645 Hệ số hồi quy tuyến tớnh là R2 =0,99936
Hỡnh 4.2.4. Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tớch pic thu được và nồng độ cỏc chuẩn α-tocopherol
+ Từ giỏ trị diện tớch peak đo được ta tớnh được hàm lượng C (mg/g). + Sau đú ta tớnh hàm lượng α-tocopherol (mg/g) cú trong mẫu bơ và xốt trứng gà tươi theo cụng thức:
C = (C0/ m) .Vdm.f
Trong đú: C: nồng độ α-tocopherol cú trong mẫu tớnh bằng (mg/g) Co: nồng độ α-tocopherol trong dịch chiết từ đường chuẩn (ppm) Vdm: Thể tớch bỡnh định mức mẫu(ml)
f : hệ số pha loóng (nếu cú) m :khối lượng mẫu (mg)
Mẫu Cỏc mẫu C0 (ppm)
Khối lượng
mẫu (mg) Diện tich pic C (mg/g)
1 Bơ 5.44835 2,0006.103 481,84274 0,067901 2 Xốt trứng gà tươi 7.98866 2,0003.103 678,94958 0,099843
Bảng 4.2.2. Kết quả phõn tớch hàm lượng α-tocopherol trong mẫu xốt trứng gà tươi và mẫu bơ
+ Hàm lượng α-tocopherol (ppm) cú trong mẫu dầu gấc được tớnh theo cụng thức: C = (C0/ V) .Vdm.f
Trong đú: C : nồng độ α-tocopherol cú trong mẫu tớnh bằng (ppm) Co: nồng độ α-tocopherol trong dịch chiết tớnh từ đường chuẩn (ppm) V : Thể tớch lấy của mẫu lấy để phõn tớch (ml)
Vdm: Thể tớch bỡnh định mức mẫu(ml) f : hệ số pha loóng (nếu cú)
Mẫu Cỏc mẫu C0 (ppm) Thể tớch mẫu (ml)
Diện tich
peak C (ppm)
1 Dầu gấc 16,10281 5ml 1308,53931 161,0281
Bảng4.2.3. Kết quả phõn tớch hàm lượng α-tocopherol trong mẫu dầu gấc
4.3. Đỏnh giỏ phương phỏp
Theo lý thuyết thống kờ, cỏc đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại là độ lệch chuẩn SD và hệ số biến thiờn CV% (RSD).