Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp lowry Nguyên tắc:
Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử Folin. Phương pháp này sử dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng thuốc thử Folin tác dụng lên gốc tyrosin, tryptophan, histydin, để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm và dựa vào đường chuẩn protein để từ đó định lượng hàm lượng protein. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein.
% 100 1 2 1 − × = m m m W
Chuẩn bị dịch protein phân tích:
- Dùng ống đong chuẩn bị 20ml NaOH 0,1N vào trong cốc dung dịch 100ml - Cân chính xác 0,5g mẫu.
- Chuyển mẫu vào cối, cho một ít dung dịch NaOH 0,1N từ cối vào để làm ẩm. - Nghiền mẫu.
- Chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác dung tích 100ml. - Tráng sạch cối chày bằng dung dịch NaOH 0,1N còn lại. - Đặt bình mẫu vào nồi cách thủy để chiết protein trong 15 phút.
- Lấy mẫu ra, làm nguội, trung hòa tới pH 7 bằng HCl 0,1N, dùng giấy pH làm chỉ thị.
- Chuyển mẫu sang bình định mức 100ml, định mức bằng nước cất tới vạch. Lắc đều.
- Lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích.
Làm phản ứng màu:
- Chuẩn bị các ống nghiệm khô, sạch.
• Mẫu thí nghiệm Lấy vào 1 ống nghiệm:
- 0,5ml dịch protein (dùng pipet).
- 5ml dung dịch C (hỗn hợp dung dịch A:B = 50:1). - Lắc đều. Để yên 10 phút.
- Cho tiếp 0,5ml dung dịch Folin. Lắc đều (dùng pipet). - Để phản ứng 30 phút.
• Mẫu kiểm chứng (làm song song với mẫu thí nghiệm) Lấy vào ống nghiệm khác:
- 0,5ml H2O (dùng pipet).
- 5 ml dung dịch C, lắc đều. Để yên 10 phút. - Cho tiếp 0,5ml dung dịch Folin. Lắc đều.
- Để phản ứng 30 phút.
• Đo độ hấp thụ
Đo độ hấp thụ của dung dịch màu của các ống thí nghiệm ở 750 nm, với dung dịch đối sánh là mẫu kiểm chứng. Ghi kết quả. Sử dụng đường chuẩn protein để xác định hàm lượng protein của dung dịch nghiên cứu.
Xây dựng đồ thị chuẩn albumin.
• Dung dịch BSA gốc: 0,5mg/ml.
• Tiến hành:
Chuẩn bị ống nghiệm sạch (6 ống). Hút lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau:
Bảng chuẩn bị dung dịch
(xây dựng đồ thị chuẩn cho phương pháp Lowry)
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 BSA gốc (0,5mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Tổng dịch C (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Dung dịch C (ml) 5 5 5 5 5 Trộn đều để yên 10 phút Dung dịch Folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Trộn đều bằng vortex, để yên 20 – 30 phút rồi đo đọ hấp phụ tại bước sóng 750nm với mẫu kiểm chứng là mẫu trong ống nghiệm số 1.
Yêu cầu: tính toán, đo và điền số liệu vào bảng tiếp theo. Nồng độ protein
(mg/ml) OD750nm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Yêu cầu: dựng đồ thịđường chuẩn bằng phần mền excel.
Xác định hàm lượng gluxit bằng phương pháp Miller Nguyên tắc:
Phương pháp dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3,5- dinitrosalisylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử. Dựa theo đồ thị chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử axit
dinitrosalisylic ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Hóa chất:
- Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối codium potassium tartrate. Đun nhẹ cho tan rồi định mức tới 100ml.
- Dung dịch glucose mẫu (500γ /ml): Cân 0,5g D-glucose pha trong nước cất thành 1 lít.
Thực hiện:
- Xây dựng đồ thị chuẩn glucose: Từ dung dịch glucose chuẩn, pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ từ 50-250 (γ /ml).
Bảng dựng đường chuẩn glucose
Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Dd glucose (0,5 mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Dd DNS (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - Lắc đều và đem đun cách thủy ở 1000C trong 3 phút, làm nguội và thêm 5ml nước cất. Đo độ hấp thụở bước sóng 530nm trên máy quang phổ. Vẽđường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose.
3.5.5.Phương pháp phân tích vi sinh vật
Xác định vi sinh vật hiếu khí tổng số theo TCVN 4884 : 2005
+ Nguyên tắc: Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện cao của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một
lượng mẫu xác định. Xem 1 khuẩn lạc là 1 sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc colony forming unit (CFU) trong một đơn vị khối thực phẩm.
+ Tiến hành:
- Chuẩn bị mẫu: Lập dãy pha loãng bằng cách lấy 1ml mẫu cần phân tích cho vào 9ml dịch đều ta được nồng độ pha loãng 10-1. Tiếp tục thực hiện như trên cho tới nồng độ pha loãng cần thiết.
- Lấy mẫu: Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến từ 25 - 250 tế bào vi sinh vật. Dùng micropipette với các đầu côn vô trùng để chuyển 1ml dịch pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy từ 2 - 3 đĩa. Sau khi cấy đổ vào mỗi đĩa 10 - 15ml môi trường PCA đã nấu chảy và làm nguội đến 45 - 50oC. Trộn đều mẫu và môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3 - 5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc.
- Nuôi ủ: Các đĩa được lật ngược lại và nuôi ủở 30oC trong 72h.
- Đọc kết quả: Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có sốđếm từ 25 - 250 tế bào vi sinh vật để tính.
Cách tính lượng khuẩn lạc được tính theo tiêu chuẩn ISO 4833/2003
N = ∑C
V. (n1 + 0,1.n2) .d Trong đó:
N -Số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1 ml mẫu C -Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n -Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V -Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường d - Độ pha loãng tương ứng