7. Bố cục của luận án
1.4.6. Phân tích POP bằng phương pháp sắc ký
1.4.6.1. Khái niệm về sắc ký
Sắc ký (chromatography) là phương pháp phân chia riêng rẽ các hợp chất hóa học trong một hỗn hợp, dựa trên định luật phân bố của các hợp chất giữa hai
pha, pha tĩnh và pha động hầu như không hòa tan vào nhau. Pha tĩnh là pha cố định không di chuyển cũng như không có thay đổi trạng thái vật lý như hòa tan, bay hơi, kết tủa v.v… trong quá trình sắc ký. Pha động là pha di chuyển trên bề mặt pha tĩnh và là chất mang của hỗn hợp các hợp chất cần phân chia. Dưới đây sẽ trình bày quy luật phân bố trong sắc ký là cơ sở của lý thuyết phân chia nhiều bậc. Để đơn giản chỉ xem xét quá trình phân bố của hai hợp chất A và B trong hỗn hợp A-B giữa hai pha khí và lỏng. Hình 1.4 trình bày sơ đồ quá trình phân bố của A và B giữa pha khí và pha lỏng và là mô hình của sắc ký cột mao quản.
Hình 1.4. Sơ đồ phân bố hai chất A và B trong hỗn hợp A-B giữa hai pha lỏng (L) và khí (G) của quá trình sắc ký dưới điều kiện nhiệt độ (T) và áp suất (P)
Trên hình 1.4 dưới điều kiện nhiệt độ (T) và áp suất (P) nhất định, chất A
trong hỗn hợp A-B sẽ tan vào pha lỏng với hàm lượng xA, nhưng đồng thời nó cũng sẽ lại bay hơi ngược trở lại vào pha khí và hàm lượng sẽ là yA. Quá trình tan vào pha lỏng và bay hơi ngược lại vào pha khí trong quá trình sắc ký của A được gọi là quá trình phân bố của chất A. Phân bố cũng xảy ra tương tự đối với chất B. Khi
phân bố đạt trạng thái cân bằng, tỷ số hàm lượng các chất giữa hai pha, thí dụ yA/xA
ở trạng thái cân bằng được gọi là hệ số phân bố . Như vậy:
A = yA/xA, và
B = yB/xB (1.1)
Hệ số phân bố có thể >1 hoặc <1. Trong trường hợp > 1 ta nói chất phân bố được làm giàu trong pha khí, ngược lại khi < 1 chất phân bố được làm giàu trong pha lỏng.
Trên hình 1.4 cũng mô tả hai quá trình phân bố của A và B là khác nhau biểu hiện qua độ dài của từng vectơ. Cũng do sự phân bố khác nhau mà tốc độ đi khỏi cột sắc ký của hai chất cũng khác nhau. Có thể thấy, do chất A phân bố vào pha lỏng kém
hơn chất B nên tốc độ di chuyển của nó theo pha động trong cột sắc ký sẽ lớn hơn (vectơ tốc độ dài hơn) so với chất B (hình 1.4).
Như vậy, do có phân bố mà ở điều kiện cân bằng hàm lượng của chất A và chất B trong cả hai pha đều sẽ khác nhau. Sự khác biệt về hàm lượng của hai chất A và B tại thời điểm cân bằng được đặc trưng bởi đại lượng gọi là hệ số phân chia (A khỏi A) .
A/B = A/B = yA.xB/yB.xA (1.2)
Nếu >> 1 thì chứng tỏ A có khả năng tách tốt khỏi B. Trong trường hợp
càng gần 1 thì chiều dài quãng đường chạy của hai chất A và B càng phải dài, để chúng có thể tách hoàn toàn khỏi nhau. Chiều dài mỗi đoạn đường để hàm lượng chất A và B đạt cân bằng, tức là có A và B được gọi là chiều cao một đĩa lý thuyết (hT). Để hai hợp chất có tính chất vật lý gần tương tự như nhau, thí dụ nhiệt độ sôi hoặc áp suất hơi bão hòa gần như nhau, có thể phân chia triệt để trên cột sắc ký cần phải có rất nhiều đĩa lý thuyết, tức là cần nhiều lần chiều cao một đĩa lý thuyết. Vì vậy, quá trình phân chia bằng phương pháp sắc ký được gọi là quá trình phân chia nhiều bậc và được tổ chức dưới dạng các loại cột sắc ký có chiều dài (chiều cao) khác nhau [11, 25, 27, 34, 72, 82, 93, 95].
1.4.6.2. Cấu tạo của một thiết bị sắc ký khí
Hình 1.5 ÷ 1.8 là hình ảnh thiết bị sắc ký khí với cột mao quản của hãng Varian thế hệ 3800 cùng với các bộ phận chính của nó. Hệ thiết bị sắc ký bao gồm các bộ phận sau:
- Đầu bơm mẫu (hình 1.6), đó là một ống kim loại một đầu hở có ren xoáy và đầu kia có một lỗ nhỏ. Đầu bơm mẫu là đầu vào buồng hóa hơi. Lỗ hở ở đầu ống được đậy bằng một miếng nhựa silicon không có tạp chất hữu cơ clo, có tính đàn hồi để qua đó bơm mẫu vào buồng hóa hơi. Vặn ren để bịt kín buồng hóa hơi. Đầu ra của buồng hóa hơi được nối chặt với cột sắc ký.
- Buồng hóa hơi nằm dưới đầu bơm mẫu nằm. Ở đây mẫu (hỗn hợp các chất cần phân chia hòa tan trong dung môi) được hóa hơi triệt để bằng cách đốt nóng. Tùy thuộc vào nhiệt độ bốc hơi của hỗn hợp mà đặt nhiệt độ buồng hóa hơi. Trong phân tích POP nhiệt độ buồng hóa hơi được đặt là 250 oC. Chất mang đồng thời là pha động được bơm liên tục vào buồng hóa hơi qua một đường ống dẫn bằng đồng bên
sườn buồng đốt để vận chuyển toàn bộ mẫu và dung môi ra khỏi buồng hóa hơi đưa vào cột sắc ký.
- Cột sắc ký (hình 1.7): Nếu là cột mao quản thì cột sẽ là một ống rỗng có đường kính trong < 1 mm, có thể là 0,25 hoặc 0,32 mm. Thành ống bên trong cột được láng một lớp dầu silicon có độ phân cực khác nhau với độ dày khoảng 20 ÷ 25 µm làm pha tĩnh. Cột sắc ký có thể có chiều dài đến 60 m và được làm từ dioxit silic (SiO2) nấu nóng chảy rồi kéo-thổi theo công nghệ hiện đại.
- Buồng ổn nhiệt cho cột sắc ký (hình 1.5). Nhiệt độ buồng sắc ký được chương trình hóa theo các bước tăng và ổn nhiệt nhất định, được điều khiển bằng chương trình máy tính. Đồng thời với chương trình tăng nhiệt độ cột là chương trình tăng áp suất đầu cột, nếu tốc độ dòng khí trong cột cần duy trì ở mức cố định.
- Detector (hình 1.6): Đây là bộ phận quan trọng để nhận biết sự xuất hiện các hợp chất sau khi đã tách và đi khỏi cột sắc ký. Trong phân tích POP, ECD kết hợp với MS thường được sử dụng hơn cả vì độ nhạy của ECD rất cao (sẽ trình bày chi tiết trong mục Giới hạn phát hiện của ECD).
Mỗi một thiết bị sắc ký ngày nay đều là một máy tính cá nhân kèm theo các chương trình điều khiển hoạt động của thiết bị cũng như để xử lý số liệu (hình 1.8).
Hình 1.5. Thiết bị sắc ký Varian 3800 (Mỹ), buồng ổn nhiệt và cột sắc ký mao quản
Hình 1.6. Đầu bơm mẫu và detector
Hai bộ phận quan trọng ở đầu vào và đầu ra của thiết bị sắc ký là đầu bơm mẫu và detector (đặt bên trong buồng chứa detector).
Hình 1.8. Máy tính ghép nối với thiết bị sắc ký
Máy tính ghép nối với thiết bị sắc ký là một bộ phận không thể thiếu trong sắc ký. Máy tính có chức năng: điều khiển các chương trình gia nhiệt, ổn nhiệt, ổn áp suất hoặc thay đổi áp suất đầu cột khi sắc ký và thực hiện các phép xử lý số liệu theo các phương pháp nội hoặc ngoại chuẩn
Hình 1.9 trình bày sơ đồ mô tả nguyên tắc hoạt động của detector ECD.
Detector ECD là một ống làm bằng sứ cách điện có hai lối vào và một lối ra. Một lối vào nối với đầu cột sắc ký để tiếp nhận khí mang cùng chất phân tích. Một lối vào để cấp khí bổ trợ, cũng là khí sử dụng làm pha động, thí dụ nitơ (N2) hoặc heli. Một lối ra là đường thải là lối thoát của khí mang, khí bổ trợ cùng mẫu phân tích. Nguyên lý hoạt động của ECD như sau.
Một dòng khí bổ trợ (N2) được bơm liên tục vào buồng với tốc độ, thí dụ là 25 ml/phút sẽ bị bức xạ của tia beta (-) phát ra từ nguồn phóng xạ 63Ni, đặt bên trong buồng detector, ion hóa tạo ra các cặp ion N2+ và e- như trình bày trong phương trình dưới đây:
N2 + - N2+ + e- (1.3) Các cặp ion N2+ và e- sẽ chuyển về điện cực âm và điện cực dương (hình 1.9) tạo ra trong buồng detector một dòng điện, dòng điện này là đường nền của detector ECD. Nếu trong dòng khí mang từ cột sắc ký đi vào buồng detector có chứa một hợp chất có nguyên tử Cl thì Cl là tác nhân bắt giữ các điện tử từ quá trình ion hóa (1.3), làm sụt đường nền của detector và tạo thành một pic (hình 1.10) vì hợp chất này chỉ ở trong buồng detector trong khoảng thời gian ngắn rồi bị đẩy ra ngoài theo đường thải.
Hình 1.10. Nguyên lý phát hiện hợp chất chứa chlor POP) của detector ECD
Pic biểu diễn trên hình 1.10 được gọi là pic lý tưởng, dạng vuông, chỉ có thể có được nếu quá trình phân bố của hợp chất cần phân tích trên cột sắc ký đạt cân bằng và không có các hiệu ứng làm ảnh hưởng đến quá trình phân bố. Chi tiết về
các dạng pic trong sắc ký có thể tham khảo trong các sách giáo khoa về kỹ thuật sắc ký, thí dụ [10, 84, 86].
Trên hình 1.10 pic đi về chiều âm nhưng trong thực tế hệ thống điện tử của thiết bị sắc ký sẽ chuyển đỉnh âm sang chiều dương như ta vẫn thường thấy trong phân tích sắc ký.
1.4.6.3. Nguyên lý định tính và định lượng trong phân tích sắc ký
Nguyên lý của phép định tính trong phân tích sắc ký là dựa vào thời gian lưu trên cột sắc ký của từng hợp chất trong mẫu. Hình 1.11 trình bày nguyên lý phân chia hợp chất A-B (hình 1.4) theo quy luật phân bố của từng hợp chất.
Hình 1.11. Nguyên lý phân chia hai chất A-B trong hỗn hợp trên cơ sở phân bố nhiều bậc trong sắc ký
Từ hình 1.11 nhận thấy: A và B cùng tồn tại trong dung dịch mẫu tại thời điểm to, là thời điểm bơm mẫu vào buồng hóa hơi. Sau khi hóa hơi mẫu được khí mang đưa
vào cột sắc ký để các thành phần của mẫu phân bố. Sau một đĩa lý thuyết (n1) có
chiều cao h1, A và B bắt đầu phân chia vì hệ số phân bố A và B khác nhau đẫn tới
A/B > 1 và ta thấy pic của B di chuyển theo chiều dài của cột chậm hơn so với pic A vì B phân bố mạnh hơn A. Tổng số đĩa lý thuyết của cột sắc ký mô tả trên hình 1.11
là i và có thể thấy sau i đĩa lý thuyết hai chất A và B đã được phân chia hoàn toàn
khỏi nhau và được detector ghi nhận dưới dạng hai pic tách rời nhau ở hai thời điểm tB và tA khác nhau (hình 1.11 bên phải).
Trong thực tế, phân bố của A và B trên cột sau mỗi đĩa lý thuyết không thể đạt cân bằng theo lý thuyết và còn chịu ảnh hưởng của nhiều hiệu ứng có bản chất vật lý và hóa lý khác nên pic của các hợp chất không thể có dạng vuông mà thường có dạng hình quả núi hoặc cân xứng (hình 1.12a), hoặc có đuôi như trình bày trên hình 1.12b.
(a) (b)
Hình 1.12. Sắc đồ của hai chất A và B trong trường hợp cùng có phân bố không mạnh (a) và B phân bố mạnh trên cột (b). Hình 1.12a cũng trình bày sơ đồ xác định
thời gian lưu tuyệt đối tR,A và tR,B của A và B
Vì B phân bố mạnh trong pha lỏng trên cột sắc ký nên pic của B không cân xứng mà có đuôi, tức là B bị “giữ” nhiều trên cột và ra khỏi cột dưới dạng “vãi” dài (hình 1.12b).
Trên hình 1.12a cũng trình diễn thời gian lưu của hai chất A và B là tR,A và tR,B và là chỉ thị để định tính A và B. Thời gian lưu tR,A và tR,B trong trường hợp này được gọi là thời gian lưu tuyệt đối. Nên nhớ rằng thời gian lưu của các hợp chất phụ thuộc nhiều vào điều kiện sắc ký. Do vậy, nếu nhiệt độ cột hoặc áp suất khí mang đầu cột có thay đổi, mặc dù sự thay đổi là rất nhỏ trong quá trình sắc ký, thì cũng sẽ có những thay đổi giá trị thời gian lưu tuyệt đối. Để khắc phục nhược điểm này, người ta không sử dụng giá trị thời gian lưu tuyệt đối mà sử dụng thời gian lưu tương đối. Thời gian lưu tương đối là tỷ số thời gian lưu tuyệt đối của chất phân tích và của một chất nội chuẩn.
Trong trường hợp này điều kiện sắc ký có thể thay đổi nhưng tỷ số thời gian lưu của mẫu và chất nội chuẩn vẫn cố định vì điều kiện sắc ký cùng có ảnh hưởng đến phân bố của cả hai hợp chất. Nguyên lý của phương pháp định tính dựa vào thời gian lưu tương đối trình bày trên hình 1.13.
Từ hình 1.13 nhận thấy thời gian lưu tương đối của A và B tương ứng sẽ được xác định bằng các công thức: IS R A R A R t t T , , , (1.4) IS R B R B R t t T , , , (1.5)
trong đó TR,A, TR,B, tR,A và tR,B, tR,IS tương ứng là thời gian lưu tương đối và tuyệt đối của hai chất A và B và chất nội chuẩn (IS)
Hình 1.13. Sắc đồ của hỗn hợp A-B cùng chất nội chuẩn để xác định thời gian lưu tương đối (công thức 1.4 và 1.5) 1.4.6.4. Định lượng trong kỹ thuật sắc ký
Nguyên tắc định lượng của phương pháp sắc ký dựa vào mối tương quan giữa diện tích pic và hàm lượng của chất cần phân tích. Phương pháp này được gọi là phương pháp ngoại chuẩn. Phương pháp ngoại chuẩn cần có đường chuẩn được
xây dựng trên cơ sở một loạt mẫu chứa hàm lượng khác nhau của các chất cần phân tích rồi sắc ký loạt mẫu chuẩn này. Kết quả là ta sẽ có các đường chuẩn mô tả sự phụ thuộc giữa hàm lượng chất cần phân tích và diện tích pic. Hình 1.14 là thí dụ hai đường chuẩn đối với chất A và chất B. Trên hình 1.14, trục tung là diện tích của các pic A (SA) và B (SB) đã được số hóa dưới dạng các xung đếm và trục hoành là hàm lượng của hai chất phân tích có đơn vị là g/L.
Hình 1.14. Đường chuẩn định lượng của hai chất A và B
Từ hình 1.14 nhận thấy một số đặc điểm như sau:
- Thứ nhất đường ngoại chuẩn có giới hạn tuyến tính, dưới mức giới hạn này hàm lượng chất phân tích phụ thuộc tuyến tính vào diện tích pic (các đường liền trên hình 1.14). Khoảng tuyến tính phụ thuộc vào độ đáp ứng của detector. Detector ECD có mức đáp ứng tuyến tính từ khoảng ppb (10-9 g/g) đến ppm (10-6 g/g), tức là khoảng tuyến tính là rất rộng. Sau giới hạn tuyến tính, diện tích đỉnh pic hầu như không còn phụ thuộc vào hàm lượng của chất cần phân tích (phần gạch cách đoạn đối với A và B).
- Đặc điểm thứ hai là độ nhạy phân tích của các chất là rất khác nhau. Trên hình 1.14 nhận thấy độ nhạy phân tích của B là cao hơn nhiều lần so với độ nhạy phân tích của A vì hệ số góc của B (kB) lớn hơn hệ số góc của A (kA). Trong trường hợp hệ số góc quá cao thì độ chính xác định lượng sẽ giảm vì thay đổi hàm lượng chất phân tích trong phạm vị hẹp đã gây thay đổi nhiều về độ đáp ứng của detector. Ngược lại, nếu độ đáp ứng của detector không cao, hay hệ số góc của đường chuẩn
quá nhỏ thì hàm lượng thay đổi nhiều mà độ đáp ứng của detector chỉ thay đổi rất ít. Cả hai trường hợp sẽ có sai số định lượng lớn. Để đảm bảo độ chính xác cần thiết cần phải chọn detector sao cho độ đáp ứng, tức là hệ số góc của phương pháp ngoại chuẩn không quá cao, cũng như không quá thấp. Yêu cầy này nhiều khí rất khó thực hiện trong thực tế.
Để loại trừ ảnh hưởng của độ đáp ứng của detector đến độ chính xác trong định lượng, phương pháp nội chuẩn được khuyến cáo sử dụng [93,95]. Trong trường hợp này người ta dùng hỗn hợp các chất chuẩn A và B có hàm lượng mỗi chất trong khoảng thường gặp trong thực tế, trong đó có nội chuẩn (IS: Internal Stndard) rồi sắc ký để biết thời gian lưu tương đối của mỗi hợp chất phân tích. Chất