7. Bố cục của luận án
2.4. QUY TRÌNH XỬ LÍ MẪU TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
2.4.1. Xử lí mẫu bùn/sa lắng
a. Tách các hợp chất POP trong mẫu bùn/sa lắng bằng chiết Soxhlet - Xử lí mẫu sơ bộ:
Tại phòng thí nghiệm mẫu bùn-sa lắng được rây lỏng qua rây bằng đồng kích thước lỗ < 1 mm để loại bỏ các lá và rễ cây, hạt sỏi v.v…Mẫu được để lắng rồi gạn kiệt hết nước và để khô trong không khí ở phòng thí nghiệm. Trước khi chiết tách lấy POP, mẫu được làm khô bằng kỹ thuật đông khô hoặc bằng cách trộn với Na2SO4 khan với tỷ lệ: mẫu/Na2SO4 = 1/3. Công đoạn làm khô là quan trọng để đảm bảo dư lượng POP không bị giữ lại trong các lỗ hổng cấu trúc, trong lòng các hạt sa lắng do nước bọc xung quanh.
- Chiết các POP trong mẫu:
Lượng mẫu bùn đem chiết là từ 1 ÷ 3 g (khối lượng khô), tùy từng loại bùn. Nếu bùn có nhiều cát thì phải lấy lượng mẫu nhiều hơn, ngược lại nếu bùn có hàm lượng sét cao, hữu cơ nhiều thì chỉ cần 1 g là đủ. Khối lượng mẫu phân tích cần được cân chính xác (±10 µg), sử dụng cân phân tích Satorius.
Sau khi cân, mẫu được cho thêm 100 ng 2,3,5-TCB và 100 ng -HCH là hai chất nội chuẩn cho hai nhóm POP là: Nhóm PCB và nhóm thuốc trừ sâu. Hai hợp chất 2,3,5-TCB và -HCH được chọn làm nội chuẩn vì đáp ứng được ba yêu cầu là không có trong môi trường, có tính chất tương tự như các hợp chất cùng phần tích vì hai hợp này là đồng đẳng và là đồng phân tương ứng của nhóm PCB và HCH, đồng thời chúng không gây phản ứng hóa học với các chất cần phân tích. Mẫu được gói vào giấy lọc băng xanh sau khi đã chiết rửa bằng n-hexan và sấy khô từ trước. Lượng n-hexan sử dụng cho mỗi lần chiết là 250 ml.
Dư lượng các POP trong mẫu được chiết vào dung môi n-hexan trên thiết bị chiết Soxhlet trong vòng 8 giờ ở nhiệt độ sôi của n-hexan với tốc độ quay vòng dung môi 5 phút/lần. Nhiệt độ chiết được duy trì bằng các bể nước nóng. Thông thường hệ thiết bị chiết Soxhlet cần có 9 ống chiết để có thể xử lý đồng thời ba mẫu với ba lần lặp.
b. Làm giàu các hợp chất POP sau chiết và xác định lượng hữu cơ trong n-hexan Dung dịch sau khi chiết được chuyển vào bình chưng cất của thiết bị cô quay (Buchi, Thụy Sĩ). Các hợp chất POP cũng như phần hữu cơ trong mẫu đã chiết vào n-hexan được làm giàu bằng cô quay dưới áp suất âm nhẹ, ở nhiệt độ 30 ÷ 35oC để đuổi dung môi đến còn < 10 ml. Chuyển vào bình định mức 10 ml, tráng rửa lại cẩn thận bình chưng cất để lấy hết các thành phần đã chiết từ mẫu. Định mức đến vạch 10 ml bằng n-hexan. Hút 100 µl bằng micro pipet và cho lên một miếng giấy nhôm đã cân bì trước. Đợi cho dung môi bay hơi hết trong điều kiện phòng thí nghiệm. Cân lại khối lượng miếng giấy nhôm để biết hàm lượng các chất hữu cơ đã chiết ra bằng dung môi n-hexan (hexane extractable organic matter, HEOM).
mHC chiết = (mHC chiết + mAl) - mAl
Số liệu này cho ta ý niệm liệu tất cả POP trong mẫu đã được chiết hết chưa? Nếu thành phân HEOM tương đương hàm lượng hữu cơ trong mẫu thì POP đã chiết hết khỏi mẫu bùn, ngược lại nếu HEOM chỉ chiếm 10 ÷ 15% so với hàm lượng hữu cơ của mẫu thì hiệu suất chiết không cao cần cải tiến quy trình chiết. Trong trường hợp nếu hiệu suất chiết thấp thì kết quả sẽ bị đánh giá thấp hơn thực tế (underestimate), mặc dù phương pháp nội chuẩn đang được áp dụng.
c. Loại bỏ các hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh trong dịch chiết bằng bột Cu
Hiệu suất thu hồi dư lượng POP từ mẫu bùn được kiểm tra bằng cách chiết 3 mẫu bùn đã thiêu kết ở 550oC trong 4 giờ để làm cháy hết các hợp chất hữu cơ, trong đó có dư lượng các POP. Trước khi chiết, mẫu bùn được trộn với 50 ng 2,3,5- TCB làm chỉ thị đánh giá hiệu suất thu hồi. Quy trình chiết và làm sạch đúng như đã mô tả trong mục 2.4.1 a, b, c. Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi của quy trình chiết và làm sạch dư lượng các POP là đạt từ 95% ÷ 105% và được trình bày chi tiết trong chương 3.
d. Làm sạch mỡ (lipid) trong mẫu và phân tách nhóm các hợp chất POP
Sau khi làm sạch các chất hữu cơ lưu huỳnh, mẫu phải được làm sạch khỏi các hợp chất mỡ cùng bị chiết theo với POP, đồng thời tách thành hai nhóm là nhóm PCB và nhóm thuốc trừ sâu (trong đó có DDT và lindan) bằng kỹ thuật sắc ký cột nhồi. Đây là sắc ký rắn-lỏng. Pha rắn là Florisil (oxit MgO) đã được sấy ở nhiệt độ 120oC qua đêm, để nguội trong bình hút ẩm và được giảm hoạt hóa bằng 4% nước theo khối lượng. Bột Florisil được chuẩn bị theo tuần. Cột sắc ký bằng thủy tinh, đường kính 1 cm, chiều cao 20 cm. Trước khi nhồi vào cột, bột Florisil được khuấy vào n-hexan rồi đổ vào cột để bột tự rơi theo trọng lực và lấp đầy theo từng lớp trên cột. Cách làm này là để bột Florisil tự sắp xếp khít với nhau làm cho hiệu quả tách và làm sạch mẫu là cao nhất. Sau khi toàn bộ bột Florisil đã nạp lên cột, cho thêm một lớp khoảng 1 ÷ 2 cm tinh thể Na2SO4 khan lên trên Florisil để hút
phần nước có trong bột đồng đã đưa vào mẫu (bước 2.4.1.c). Toàn bộ dung môi n- hexan trong cột được tháo bỏ cho vừa đến bề mặt lớp chất rắn (Chú ý: không bao
giờ được để bột khô). - Phân đoạn I
Dội dung dịch mẫu lên cột và tháo cho dung môi chảy khỏi cột sao cho dung môi vừa đến bề mặt pha rắn, bỏ phần dung môi này. Rửa giải bằng 75 ml n-hexan. Toàn bộ PCB cùng aldrin, o,p-DDE, p,p’-DDE sẽ được rửa giải bằng n-hexan trong phân đoạn I này.
Phân đoạn I được cô quay đuổi dung môi đến còn khoảng 5 ml thì chuyển vào ống đựng mẫu có chia vạch rồi dùng dòng khí N2 khô và sạch đuổi tiếp dung môi đến còn đúng 1 ml.
- Phân đoạn II
Rửa giải tiếp cột Florisil bằng hỗn hợp dung môi: 25 ml diclormetan (CH2Cl2) trong 50 ml n-hexan. Dư lượng thuốc trừ sâu nhóm DDT và lindan sẽ được rửa giải trong phân đoạn II này.
Phân đoạn II được cô quay đuổi hết dung môi rồi tráng rửa bình bằng 5 ml n- hexan sau đó chuyển sang ống đựng mẫu khắc vạch và đuổi tiếp dung môi bằng dòng khí nitơ sạch cho đến đúng vạch 1 ml. Hai phân đoạn đã được chuẩn bị cho sắc ký.
Toàn bộ các bước của quy trình xử lý mẫu bùn/sa lắng để định lượng dư lượng các hợp chất POP được mô tả trên hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu bùn/sa lắng tại phòng thí nghiệm để phân tích dư lượng các hợp chất POP
2.4.2. Xử lí mẫu nước
Đối với các mẫu nước quy trình phân tích đơn giản hơn. Mẫu nước được lọc qua màng lọc milipore kích thước lỗ 0,45 µm để loại các chất lơ lửng, huyền phù. Lọc mẫu nước trước khi xử lý là khâu rất quan trọng nhằm loại bỏ triệt để phần lơ lửng trong mẫu. Phần lơ lửng là những tâm hấp phụ các hợp chất hữu cơ rất mạnh, trong đó có cả các hợp chất POP. Hệ số phân bố POP giữa pha nước và pha lơ lửng rất cao (logKd thường từ 5 ÷ 6 [55]). Như vậy, nếu không lọc mẫu nước thì kết quả phân tích sẽ phạm sai số dương, không phản ánh thực trạng hàm lượng POP trong môi trường nước.
Lấy 500 ml mẫu nước đã lọc chiết với 250 ml n-hexan loại PG, lắc trên máy trong khoảng 1 giờ, tốc độ lắc 80 lần/phút. Trước khi chiết cho thêm các chất nội chuẩn là 2,3,5-triclorobiphenyl (TCB) và -HCH, mỗi chất là 100 ng.
Hình 2.3 trình bày các bước của quy trình xử lý mẫu nước để phân tích dư lượng các hợp chất POP.
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu nước tại phòng thí nghiệm phân tích dư lượng các hợp chất POP
Giai đoạn lọc mẫu nước là rất cần thiết, để loại bỏ các hạt lơ lửng, các chất keo hữu cơ trong mẫu, vì chúng cũng có khả năng bị chiết vào pha hữu cơ, gây khó khăn cho giai đoạn phân chia và làm sạch nhóm POP bằng sắc ký trên cột Florisil sau này. Kỹ thuật phân tích sắc ký dư lượng các POP được áp dụng có thể là GC- ECD hoặc GC-MS.
Có sự khác biệt giữa hai quy trình xử lý mẫu bùn/sa lắng và mẫu nước. Đó là đối với mẫu nước không cần xử lý sau chiết bằng bột đồng, trong khi giai đoạn này là bắt buộc đối với mẫu bùn/sa lắng. Sở dĩ có sự khác biệt này là do trong mẫu nước hàm lượng các chất hữu cơ lưu huỳnh rất thấp, không gây nhiễu đường nền sắc đồ.
Hiệu suất thu hồi của quy trình chiết tách POP từ mẫu nước được kiểm tra bằng chiết 500 ml nước khoáng tinh khiết đóng chai được trộn với 50 ng 2,3,5- TCB. Các bước tiến hành tương tự như đối với mẫu hiện trường. Kết quả được trình bày chi tiết trong chương 3.
2.5. NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO PHÂN TÍCH POP 2.5.1. Nghiên cứu lựa chọn dung môi để chiết các POP từ mẫu phân tích 2.5.1. Nghiên cứu lựa chọn dung môi để chiết các POP từ mẫu phân tích
Trong kỹ thuật sắc kí GC-ECD, việc lựa chọn dung môi có ý nghĩa quan trọng đến kết quả phân tích. Đặc biệt dung môi dùng cho máy Varian 3800 của Mỹ có gắn Detector ECD yêu cầu sử dụng dung môi siêu sạch.
- Dung môi n-hexan PA của hãng Prolabo Pháp.
- Dung môi n-hexan PG (Pesticide Grade – sạch cho phân tích dư lượng HCBVTV) của hãng Prolabo Pháp.
Lý do chọn sản phẩm của hãng Prolabo là vì nhà cung cấp có sản phẩm đóng chai 5 lít/chai nên giá thành giảm đi được khoảng 10% so với sản phẩm của hãng Merck (Đức) chỉ có loại 1 lít/chai lưu hành trên thị trường Việt Nam.
Tiến hành chạy sắc kí đồ trong cùng điều kiện, nếu loại dung môi nào cho kết quả đường nền phẳng, ít hoặc không nhiễu, sẽ được chọn.
2.5.2. Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật chiết và xác định hiệu suất thu hồi của quá trình chiết các hợp chất POP từ mẫu bùn trình chiết các hợp chất POP từ mẫu bùn
Có 3 phương pháp chiết: Chiêt Soxhlet, chiết lắc và chiết siêu âm được sử dụng để tách các hợp chất POP. Chúng tôi cần nghiên cứu lựa chọn phương pháp thích hợp.
Chuẩn bị 3 mẫu như nhau, mỗi mẫu gồm: 3g mẫu bùn và 500 ml nước cất, thêm 100 ng 2,3,5-TCB. Tiến hành chiết tách bằng 3 phương pháp (Soxhlet, lắc, siêu âm), dịch chiết đều được cô quay làm giàu và làm sạch trên cột Florisil. Sử dụng 2,3,5-TCB làm chất chỉ thị trong nghiên cứu xác định hiệu suất thu hồi (vì nó không có trong môi trường nên có thể thêm trực tiếp vào mẫu cần phân tích). Điều này là rất có ý nghĩa vì tính chất của mẫu thực sẽ không còn là yếu tố khác biệt trong hai trường hợp: xử lí mẫu giả và mẫu thực.
Quá trình chiết được thử nghiệm với ba phương pháp là chiết Soxhlet ở nhiệt độ sôi của dung môi, chiết trên máy lắc và chiết siêu âm đều ở nhiệt độ phòng. Dung môi chiết đều là n-hexan và thời gian chiết đều là 8 giờ. Hàm lượng 2,3,5- TCB được xác định bằng phương pháp ngoại chuẩn. Kết quả thu hồi (hay hiệu suất chiết tách) được trình bày trong chương 3, bảng 3.1.
2.5.3. Nghiên cứu xác định thời gian chiết tối ưu để đạt hiệu suất thu hồi cao Hiệu suất thu hồi của quá trình chiết tách các hợp chất POP bằng kỹ thuật Hiệu suất thu hồi của quá trình chiết tách các hợp chất POP bằng kỹ thuật chiết Soxhlet với dung môi n-hexan là tốt nhất (kết quả trình bày trong chương 3 hình 3.3). Để chọn khoảng thời gian chiết tối ưu nhằm đạt hiệu suất thu hồi cao, chúng tôi tiến hành 3 lần chiết lặp một mẫu bùn có cho thêm 100 ng 2,3,5-TCB ở
các khoảng thời gian khác nhau từ 2 ÷ 8 giờ. Hiệu suất thu hồi là kết quả trung bình (cùng với sai số chuẩn) của 3 lần chiết.
2.5.4. Nghiên cứu xử lí các hợp chất hữu cơ chứa S trong dịch chiết bằng bột Cu Hàm lượng các hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh trong mẫu bùn thường rất Hàm lượng các hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh trong mẫu bùn thường rất cao, cao hơn hẳn các hợp chất POP. Nếu không làm sạch các tạp chất hữu cơ lưu huỳnh thì chúng sẽ trùm hết các pic của POP gây nhiễu. Bởi vậy, đối với các mẫu bùn-sa lắng, khâu làm sạch các hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh trước khi phân tích định lượng POP là khâu quan trọng và bắt buộc.
Phương pháp làm sạch các hợp chất hữu cơ lưu huỳnh là khử bằng bột Cu. Để làm việc này người ta cho vào dung dịch mẫu sau chiết (trước khi làm giàu), khoảng 1 g bột Cu để khử các hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh. Thông thường sau khoảng 2 ÷ 3 phút, bột đồng chuyển sang màu đen xám, đó là màu của CuS. Khâu làm sạch các hợp chất hữu cơ lưu huỳnh được tiến hành trong khoảng 10 ÷ 15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ hỗn hợp để tăng tốc độ phản ứng.
2.5.5. Nghiên cứu lựa chọn chế độ nhiệt tối ưu cho cột sắc kí
Chế độ làm việc của thiết bị sắc ký:
- Nhiệt độ buồng hóa hơi: 250oC; Nhiệt độ buồng detector: 290oC - Tốc độ dòng khí mang (N2): cố định là 1,2 ml/phút;
- Tốc độ dòng khí bổ trợ (N2): 25 ml/phút được đưa liên tục vào buồng detector để tạo đường nền là dòng điện tử do phân ly khí N2;
- Bật chế độ làm việc của chương trình tự điều chỉnh mức không của đường nền. Chế độ sắc ký tối ưu bao gồm áp suất đầu cột của khí, thời gian để hóa hơi trong buồng hóa hơi cũng như các thông số khác đã được nghiên cứu lựa chọn kỹ lưỡng.
Nhưng với các hợp chất POP tốc độ gia nhiệt cho cột quyết định điều kiện cân bằng phân bố hợp chất phân tích giữa hai pha khí, lỏng và quyết định thời gian phân tích cho một mẫu. Nếu tăng tốc độ gia nhiệt thì thời gian phân tích một mẫu sẽ giảm xuống, nhưng phân bố khó đạt cân bằng và hệ quả là chiều cao một đĩa lý thuyết sẽ tăng lên làm cho độ phân giải của các hợp chất POP sẽ giảm đi. Nói cách khác là kết quả phân tích sẽ kém chính xác.
độ gia nhiệt đối với cột sắc ký ở các nhiệt độ khác nhau. Sử dụng mẫu chuẩn của Aroclo 1254 với hai chế độ gia nhiệt cột sắc ký tương ứng là 7oC/phút và 3oC/phút. Hỗn hợp Aroclo 1254 là một loại dầu công nghiệp có mức clo hóa là 54% theo trọng lượng phân tử (số 12 là để chỉ hợp chất có 12 nguyên tử cacbon, tức là có cấu trúc hai mạch benzen nối với nhau). Hỗn hợp này bao gồm các CB có mức clo hóa từ di- đến octa-, tức là từ hai đến 8 vị trí cacbon trong phân tử được clo hóa.
Chế độ sắc ký tối ưu được lựa chọn như sau: - Giữ nhiệt độ buồng cột 65oC trong vòng 1 phút
- Tăng nhiệt độ buồng cột với tốc độ: 3oC/phút đến nhiệt độ 250oC - Giữ nhiệt độ buồng cột ở 250oC trong thời gian 7 phút.
Hình 2.4 trình bày chế độ gia nhiệt buồng cột sắc ký các hợp chất POP cuả thiết bị VARIAN 3800, cột mao quản Rtx-5 có đường kính trong Φ0,32 mm, lớp