7. Bố cục của luận án
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO PHÂN TÍCH POP
3.1.1. Kết quả nghiên cứu lựa chọn dung môi để chiết các hợp chất POP từ mẫu bùn và mẫu nước
Hình 3.1 và hình 3.2 trình bày sắc đồ 2 loại dung môi n-hexan có độ sạch tương ứng loại PA và PG (Pesticide Grade - để phân tích dư lượng thuốc trừ sâu) của hãng Prolabo Pháp. 5 10 15 20 25 30 Minutes -22 0 50 100 150 mVolts WIWI:4:2 WI:4 WI:2 WI:4 FPFP+- WI:8
Hình 3.1. Sắc đồ GC-ECD của dung môi n-hexan loại PA, hãng Prolabo (Pháp)
10 20 30 40 50 60 70 Minutes -1.8 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 m Volts 2 .8 0 6 2 .8 9 1 WI:2GR+ GR- FPFP+- FPFP+-FPFP+-FPFP+FP-FP+-FPFP+- FPFP+- FPFP+FP-FP+- FPFP+- FPFP+-FPFP+- FPFP+-FPFP+-
Từ các sắc đồ trên các hình 3.1 và 3.2 ta thấy: Khi sử dụng dung môi n- hexan loại PA thì đường nền vẫn bị nhiễu, điều này khẳng định dung môi loại PA còn chứa một số tạp chất clo hóa. Nếu sử dụng dung môi loại PA thì sẽ dẫn đến kết quả phân tích có thể phạm phải sai số dương.
Vì thế trong các phép phân tích, chúng tôi lựa chọn dung môi n-hexan loại PG của hãng Prolabo (Pháp).
Một số thử nghiệm về độ sạch của dung môi n-hexan loại PA và PG của hãng Merck cũng cho kết quả sắc đồ tương tự (xem phụ lục 3).
3.1.2. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi của kỹ thuật chiết Soxhlet và so sánh với chiết lắc và siêu âm khi tách các hợp chất POP từ mẫu bùn
Kết quả xác định hiệu suất thu hồi của 3 phương pháp chiết (hay hiệu suất chiết tách) được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết tách POP bằng ba phương pháp Soxhlet, lắc, siêu âm (dung môi: n-hexan, thời gian 8 giờ)
Phương pháp chiết
Lượng 2,3,5- TCB cho thêm vào mẫu
(ng)
Tìm thấy (ng)
Hiệu suất thu hồi, %
Lắc 100 93 ± 8 96 ± 8
Siêu âm 100 96 ± 5 93 ± 5
Soxhlet 100 93 ± 8 93 ± 8
Kết quả trong bảng 3.1 cho thấy: cả ba phương pháp chiết đều có hiệu suất thu hồi tốt, đáp ứng được yêu cầu chiết để tách các hợp chất POP từ mẫu bùn/sa lắng. Tuy nhiên, hai phương pháp chiết lắc và siêu âm có hai nhược điểm cơ bản là: - Quá trình tách pha (lỏng và rắn) sau chiết rất chậm (thông thường, sau khi chiết cần đợi ít nhất là 4 giờ để phân pha mới có thể gạn lấy dịch chiết).
- Cần phải rửa lại bùn để tận thu hết lượng POP đã chiết vào dung môi. Vì thế, tổng thể tích dung môi n-hexan dùng để chiết và rửa sẽ tăng gấp đôi so với chiết Soxhlet. Dung môi sau khi chiết có thể được tái sử dụng, nhưng để dung môi đạt độ sạch PG cần phải có công đoạn chưng cất làm sạch rất công phu trên thiết bị đặc
biệt. Hiện nay, dung môi chiết trong phân tích POP của chúng tôi vẫn được lưu giữ tại phòng thí nghiệm, khi có điều kiện mới chưng cất để tái sử dụng.
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết Soxhlet để tách các hợp chất POP từ các mẫu bùn. Phương pháp chiết Soxhlet được chọn vì đó là phương pháp phù hợp với điều kiện các phòng thí nghiệm ở Việt Nam. Hơn nữa, ưu điểm nổi bật của kỹ thuật chiết Soxhlet là không phải chờ phân pha, không phải rửa lại mẫu bùn và như vậy có thể tiết kiệm được thời gian và dung môi chiết một cách đáng kể.
Riêng đối với mẫu nước, chiết bằng kỹ thuật lắc hoặc chiết siêu âm đều có hiệu suất thu hồi tốt (từ 95% ÷ 105%) trong khoảng thời gian ngắn, không dài hơn 1 giờ. Do vậy, trong nghiên cứu này các mẫu nước đều được chiết bằng kỹ thuật lắc với dung môi n-hexan (80 vòng/phút) trong thời gian 1 giờ sau khi mẫu đã được lọc qua phin milipore 0,45 m.
3.1.3. Kết quả xác định thời gian chiết tối ưu để đạt hiệu suất thu hồi cao
Hiệu suất thu hồi của quá trình chiết tách các hợp chất POP bằng kỹ thuật chiết Soxhlet với dung môi n-hexan theo thời gian được trình bày trên hình 3.3. Trong đó hiệu suất thu hồi là kết quả trung bình (cùng với sai số chuẩn) của 3 lần chiết lặp một mẫu bùn có thêm 100 ng 2,3,5-TCB.
Hình 3.3. Hiệu suất thu hồi POP từ mẫu bùn theo thời gian chiết (Kỹ thuật chiết: Soxhlet, dung môi: n-hexan, nhiệt độ chiết: 45 oC)
Từ kết quả trên hình 3.3 cho thấy: Trong khoảng thời gian chiết từ 6 ÷ 8h đều thu được hiệu suất chiết khá cao (> 90%), nhưng với thời gian chiết 8 giờ là tốt nhất. Vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi chọn thời gian chiết là: tTối ưu = 8 giờ. 3.1.4. Kết quả xử lí các hợp chất hữu cơ chứa S trong dịch chiết mẫu bùn bằng bột Cu
Thực hiện xử lí mẫu bùn như mục 2.5.4, kết quả ghi sắc đồ các hợp chất POP trong hai trường hợp xử lí và không xử lí bằng bột Cu được trình bày trên hình 3.4 và 3.5. 10 20 30 40 50 60 70 Minutes -193 0 250 500 750 mVolts
Hình 3.4. Sắc đồ GC-ECD của một mẫu bùn trong trường hợp không xử lý dung dịch sau chiết dung môi bằng bột Cu
10 20 30 40 50 60 70 Minutes -0.17 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Volts T C B A ld ri n C B 4 4 C B 1 0 1 o ,p -D D E C B 9 7 p ,p '- D D E C B 1 1 8 C B 1 3 2 + 1 5 3 C B 1 0 5 C B 1 3 8 + 1 5 8 C B 1 2 8 C B 1 8 0 CB 1 7 0
Hình 3.5. Sắc đồ GC-ECD của một mẫu bùn trong trường hợp có xử lý dung dịch sau chiết dung môi bằng bột Cu
Từ các sắc đồ GC-ECD trình bày trên hình 3.4 và 3.5 cho thấy: khi xử lí dịch chiết mẫu bùn/sa lắng bằng bột Cu, pic thu được có độ phân giải cao, không còn ảnh hưởng của tạp chất, đặc biệt là trong khoảng thời gian từ 30 ÷ 55 phút sắc ký. Điều đó khẳng định công đoạn xử lí loại bỏ các hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh là quan trọng và cần thiết (xem phụ lục 4).
3.1.5. Kết quả nghiên cứu chế độ nhiệt tối ưu cho cột sắc kí
Chế độ sắc ký tối ưu được lựa chọn được trình bày trong mục 2.5.5.
Hình 3.6 và 3.7 trình bày sắc đồ mẫu chuẩn của Aroclo 1254 với hai chế độ gia nhiệt cột sắc ký tương ứng là 7oC/phút và 3oC/phút. Hỗn hợp Aroclo 1254 là một loại dầu công nghiệp có mức clo hóa là 54% theo trọng lượng phân tử (số 12 là để chỉ hợp chất có 12 nguyên tử cacbon, tức là có cấu trúc hai mạch benzen nối với nhau). Hỗn hợp này bao gồm các CB có mức clo hóa từ di- đến octa-, tức là từ hai đến 8 vị trí cacbon trong phân tử được clo hóa.
10 20 30 40 50 60 70 Minutes -0.11 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Volts
WI:2 WI:4 WI:8 FP+
FPFP-FP+-FP+FP- FP+FP- FPFP+- FPFP+FPFP-+-FPFP+- FP+ FP-WI:4 WWI:2I:4WI:8
Hình 3.6. Sắc đồ GC-ECD của Aroclo 1254 với chế độ gia nhiệt 7oC/phút (các chế độ khác được giữ nguyên như trình bày trong mục 2.4.5.2)
10 20 30 40 50 60 70 Minutes -4 0 10 20 30 40 mVolts W I:2 GR+GRWI-:4WI:2 W I:4 WI:8 WIW I:4:8 FPFP+-W I:4WI:8 FPFP+-FPFP+FP-FPFP+-FPFP+-FPWI+-:4 FP+FP-FPFPFPFP+-+- FPWIFP+FP:8-FP+-FPFP+- FPFP+-FPFP+- W I:16
Hình 3.7. Sắc đồ GC-ECD của Aroclo 1254 với chế độ gia nhiệt 3 oC/phút (các chế độ khác được giữ nguyên như trình bày trong mục 2.4.5.2)
Các sắc đồ trên các hình 3.6 và 3.7 cho thấy:
- Với chế độ gia nhiệt 7oC/phút cho cột sắc ký ta thu được phổ đồ có độ phân giải của hỗn hợp Aroclo 1254 không rõ.
- Với chế độ gia nhiệt 3oC/phút cho cột sắc ký ta thu được phổ đồ có độ phân giải của hỗn hợp Aroclo 1254 rất rõ.
Vì vậy, trong các các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi chọn chế độ gia nhiệt cho cột sắc ký là: 3oC/phút.
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH BẰNG CHƯƠNG TRÌNH KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG TRÌNH KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG
Chất lượng quy trình phân tích mẫu bùn trong trường hợp này là độ chính xác của các kết quả đối với từng chỉ tiêu phân tích. Chương trình kiểm soát chất lượng phân tích đã được kiểm chứng bằng cách tham gia vào phép phân tích so sánh quốc tế với một mẫu sa lắng lấy từ vịnh Vernice (Italia) có ký hiệu là IAEA-459. Phép phân tích so sánh quốc tế này do Phòng thí nghiệm nghiên cứu môi trường biển của Cơ quan Năng lượng nguyên tử quốc tế có trụ sở tại Công quốc Monaco tổ
chức trong năm 2012.
Theo thông báo của Ban tổ chức phân tích so sánh thì mẫu được lấy tổng cộng khoảng 50 kg ướt. Mẫu được xử lý để chỉ lấy phần có kích thước hạt < 1 mm rồi làm khô bằng phương pháp đông khô. Phòng thí nghiệm Monaco đã kiểm chứng và khẳng định là mẫu có độ đồng đều cao. Mẫu được đóng vào các lọ thủy tinh màu nâu với khối lượng khoảng 50 g mỗi lọ. Mẫu được gửi đến 91 phòng thí nghiệm khác nhau trên toàn thế giới. Đây là các phòng thí nghiệm có thư mời và nhận lời tham gia. Việt Nam chỉ có một phòng thí nghiệm của Viện Khoa học và kỹ thuật hạt nhân, nơi NCS làm thực nghiệm tham gia.
Sau ba tháng, tất cả 91 phòng thí nghiệm đều thông báo kết quả của mình để Ban tổ chức xử lý số liệu. Phương pháp xử lý là thống kê tìm những giá trị có mức cao hoặc thấp bất thường (outlier) đối với từng chỉ tiêu phân tích để loại ra ngoài không xử lý tiếp bằng các phương pháp thích hợp, thí dụ như “t-test”, “non- parametric” hoặc “ANOVA analysis”. Sau đó tìm giá trị trung bình của từng chỉ tiêu và độ lệch chuẩn của chúng. Với các số liệu này từng phòng thí nghiệm sẽ kiểm tra mức độ chính xác của số liệu mà mình cung cấp thông qua tỉ số Z (Z-score). Tỉ số Z được định nghĩa là: X X score Z i (3.1)
Trong đó Xi là hàm lượng trung bình của một chỉ tiêu nhất định do phòng thí nghiệm i cung cấp; X là giá trị hàm lượng trung bình của chính chỉ tiêu đó tính chung cho tất cả các phòng thí nghiệm đã cung cấp số liệu và là độ lệch chuẩn của giá trị X .
Tiêu chuẩn để một kết quả phân tích có độ chính xác được chấp nhận là giá trị tỉ số Z phải 3. Bảng 3.2 trình bày kết quả phân tích so sánh quốc tế mẫu IAEA- 459 (2012) của NCS.
Bảng 3.2. Kết quả định lượng các hợp chất POP trong mẫu so sánh quốc tế IAEA- 459 (sa lắng vịnh Vernice, Italy) của NCS và hàm lượng trung bình của từng chỉ
tiêu tương ứng của 91 phòng thí nghiệm tham gia phép thử (12/2012) [46]
STT Hợp chất phân tích Hàm lượng ng/g (ppb)
Kết quả của NCS Kết quả quốc tế
1 HCB 0,12 ± 0,43 2,16 ± 2,47 2 Lindan 1,25 ± 0,62 3,78 ±1,63 3 p,p'-DDE 4,27 ± 0,68 3,57± 1,62 4 p,p'-DDD 2,94 ± 0,14 4,52 ± 0,89 5 p,p'-DDT 6,07± 0,17 5,16 ± 3,25 6 o,p'-DDE 1,16 ± 0,13 0,42 ± 1,07 7 o,p-DDD 0,88 ± 0,11 0,27 ± 0.53 8 o,p-DDT 1.48 ± 0.34 0.75 ± 0.58 9 Aldrin 0,21 ± 0,63 2,14 ± 1,14 10 Dieldrin 0,26 ± 0,46 2,51 ± 0,58 11 Endrin 6,30 ± 0.59 5,73 ± 3,22 12 Heptachlor 1,51 ± 0,37 2,58 ± 0,62 13 cis-Heptachloroepoxide 0,18 ± 0,72 4.52±0.68 14 trans-Heptachloroepoxide 0,15±0,58 6.24 ± 3,46 15 Edosulfan 12,72 ± 0,63 8,26 ± 2,57 16 Endosulfan sulphate 34,75 ± 3,82 25,17 ± 5,72 17 cis-chlordane 0,19 ± 0.02 1,33 ± 1,42 18 trans-Chlordane 0,12 ± 0,04 0,72 ± 0,48 19 PCB28 1,67 ± 0,21 3,26 ± 1,28 20 PCB52 4,77 ± 0,34 5,62 ± 2,84 21 PCB101 3,60 ± 0,27 4,27 ± 1,57 22 PCB138 3,33 ± 0,36 1,32 ± 0,79 23 PCB153 2,22 ± 0,17 4,56 ± 2,37 24 PCB180 1,64 ± 0,28 2,42 ± 1,56 25 Aroclor 1260 (equiv) 53,38 ± 2,83 47,27 ± 12,45 26 Aroclor 1254 (equiv) 80,94 ± 3,51 97,18 ± 17,47
Kết quả trong bảng 3.2 cho thấy: tất cả các chỉ tiêu phân tích mà NCS nhận được từ mẫu IAEA-459 đều có giá trị tỉ số Z < 3. Thí dụ: NCS phát hiện được hàm lượng lindan trong mẫu là 1,25 ng/g khối lượng khô (KLK), trong khí đó giá trị hàm lượng lindan của mẫu tính trung bình của 90 số liệu từ 90 phòng thí nghiệm khác là 3,78 ng/g KLK và độ lệch chuẩn là 1,63 ng/g KLK (bảng 3.2). Như vậy, tỉ số Z đối với chỉ tiêu lindan của NCS là (1,253,78)/1,63 1,55. Tương tự đối với p,p’-DDT giá trị tỉ số Z là (6,075,15)/3,25 0,28.
Có thể khẳng định rằng với các chỉ tiêu POP có hàm lượng cao hơn giới hạn phát hiện từ 1,5 lần trở lên thì các kết quả phân tích của NCS là có độ chính xác tốt, giá trị tỉ số Z không lớn hơn 1.
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH LOD VÀ LOQ CỦA PHƯƠNG PHÁP GC-ECD ĐỂ PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT POP TRONG MẪU ĐỂ PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT POP TRONG MẪU
Phương pháp xác định LOD và LOQ được trình bày trong mục 2.7 và kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 trình bày sự phụ thuộc giữa diện tích pic của 2,3,5-TCB do máy GC -ECD xác định và hàm lượng của hợp chất đã cho thêm vào mẫu bùn. Diện tích pic được số hóa dưới dạng số đếm, tương đương số điện tích do TCB tạo ra trong buồng detector do đã bắt điện tử.
Bảng 3.3. Mối tương quan giữa hàm lượng [TCB] với sai số ± 2%(ng/ml) và diện tích pic (S) trên sắc đồ GC-ECD với 8 mẫu thêm có hàm lượng TCB khác nhau
[TCB] ± 2% (ppb) Diện tích pic, S (10-3) Sai số của S, (%)
5 7,25 46 10 15,3 17 20 28,3 12 30 39,1 8 40 52,3 8 50 65,5 7 60 74,1 5 70 90,3 7
Trên cơ sở các số liệu của bảng 3.3, xây dựng sự phụ thuộc giữa [TCB] và diện tích pic S. Hình 3.8 trình bày đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa hàm lượng [TCB] và diện tích pic của sắc đồ (S).
Hình 3.8. Mối tương quan giữa hàm lượng TCB trong dịch chiết và diện tích pic trên sắc đồ GC-ECD (VARIAN 3800, Mỹ)
Từ hình 3.8 nhận thấy: mối tương quan giữa hàm lượng [TCB] và diện tích đỉnh pic có dạng:
[TCB] = 0,75(S/1000) + 0,33 (3.2) Như vậy, tín hiệu đường nền của phương pháp tương đương hàm lượng TCB là 0,33 ng/ml, tức là khi hàm lượng TCB bằng 0 thì tín hiệu đường nền có giá trị tương đương 0,33 ng/ml. Theo định nghĩa thì
LOD = 3. bkg = 3 .0,33 ≈ 1,0 ng/ml (tương đương 1 ng/g hay 1 ppb) (3.3) trong đó bkg là tín hiệu đường nền đã trình bày ở phần trên.
Thông thường lượng mẫu bùn/sa lắng được lấy là 1 g theo khối lượng khô để phân tích dư lượng các hợp chất POP. Sau quá trình chiết tách, làm sạch, phân nhóm thể tích dung dịch n-hexan chứa dư lượng các POP được đưa về đúng 1 ml và mỗi lần bơm lên cột sắc ký 2 l để phân tích. Do đó LOD của phương pháp được xác định là 1 ng/g hay 1 ppb. Tuy nhiên, ở vùng hàm lượng thấp, độ không đảm bảo đo thường lên tới 100%, nên LOD của phương pháp được chấp nhận là 2 ng/g tức là 2 ppb. Do đó giới hạn định lượng của phương pháp LOQ = 3 LOD = 3.2 = 6 ng/g (tức 6 ppb).
3.4. KẾT QUẢ ĐO SẮC ĐỒ HAI PHÂN ĐOẠN CỦA MẪU PHÂN TÍCH Thực hiện xử lí mẫu như mô tả trong mục 2.4.1. ta thu được hai phân đoạn.