Sau khi điện di kiểm tra ADN tổng số trên gel Agarose 1%, chúng tôi nhận thấy các băng ADN tổng số tương đối sáng, gọn. Đồng thời, khi tiến hành đo độ hấp thụ ánh sáng tia tử ngoại của ADN tổng số để đánh giá độ tinh sạch cũng như lượng ADN bằng máy đo quang phổ Nano Drop. Kết quả cho thấy các mẫu ADN đều có chỉ số A260/ A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0. Chứng tỏ lượng ADN trong mẫu thu được là sạch đủ điều kiện để tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo.
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu MP9 với khuôn là ADN tổng số được tách từ mô, khuếch đại đoạn gen có kắch thước lý thuyết 596bp bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7% nhuộm EtBr, quan sát dưới tia UV bước sóng 245nm. Kết quả điện di được thể hiện như trong hình 6.
Hình 6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR promoter gen MMP-9 từ ADN tổng số tách từ mô
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 2-3: Sản phẩm PCR từ mẫu mô lân cận u và mẫu mô u của bệnh nhân mã 39799 Giếng 4-5: Sản phẩm PCR từ mẫu mô lân cận u và mẫu mô u của bệnh nhân mã 36474 Giếng 6-7: Sản phẩm PCR từ mẫu mô lân cận u và mẫu mô u của bệnh nhân mã 37456 Giếng 8: Sản phẩm PCR từ mẫu mô lân cận u của bệnh nhân mã 42440
34
Kết quả điện di cho thấy đã thu được sản phẩm PCR có kắch thước khoảng 596bp, phù hợp với lý thuyết. Các băng rõ nét và không xuất hiện băng phụ, chứng tỏ không có hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu.
Để xác định những biến đổi trong vùng promoter gen MMP-9, chúng tôi tiến hành cắt sản phẩm PCR đoạn ADN trên promoter MMP-9 đã khuếch đại thành công bằng enzyme giới hạn SphI.
Trên lý thuyết, với những mẫu chứa biến đổi C thành T tại vị trắ -1562
trên vùng promoter gen MMP-9 thì đoạn ADN có kắch thước 596 bp sẽ chứa
trình tự nhận biết của enzyme giới hạn, kết quả là đoạn ADN sẽ bị cắt thành hai đoạn nhỏ với kắch thước lần lượt là 358bp và 238bp, khoảng cách giữa hai băng là 120bp. Ngược lại, những mẫu không có biến đổi sẽ giữ nguyên kắch thước. Sản phẩm của quá trình cắt enzyme được điện di kiểm tra cùng với sản phẩm PCR trên gel Agarose 1,7% nhuộm EtBr và được quan sát dưới tia UV bước sóng 245nm (Hình 7).
Hình 7: Hình ảnh điện di kết quả cắt enzyme sản phẩm PCR từ ADN tổng số của mô Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 2-3: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô lân cận u của bệnh nhân mã 3035 (chỉ xuất hiện biến đổi ở mẫu mô lân cận u)
Giếng 4-5: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô u của bệnh nhân mã 41767 (chỉ xuất hiện biến đổi ở mẫu mô u)
Giếng 6-7 : Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô lân cận u của bệnh nhân mã 4841 (enzyme cắt không hoàn toàn)
35
Giếng 8-9: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô u của bệnh nhân mã 4841 (enzyme cắt không hoàn toàn)
Giếng 10-11: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô lân cận u của bệnh nhân mã 38784 (enzyme cắt hoàn toàn)
Giếng 12-13: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô u của bệnh nhân mã 38784 (enzyme cắt hoàn toàn)
Từ kết quả trên hình 7, chúng tôi đã nhận thấy sản phẩm PCR sau khi cắt
bằng enzyme SphI trên bản điện di xuất hiện hai băng có kắch thước khoảng
358bp và 238bp nên được dự đoán là có xuất hiện biến đổi C→T trong đoạn ADN nghiên cứu. Chúng tôi tiếp tục tiến hành cắt enzyme với mẫu của 99 bệnh nhân ( bao gồm mẫu mô u và mẫu mô lân cận u), kết quả thu được có 19 bệnh nhân khi điện di sản phẩm cắt thu được hai băng có kắch thước tương tự như hình 7. Từ kết quả thu được, chúng tôi tiến hành so sánh với trình tự tham khảo, và có thể kết luận rằng: Có sự xuất hiện biến đổi C thành T tại vị trắ -1562 trên vùng
promoter gen MMP-9 trong các mẫu nghiên cứu. Ngoài ra chúng tôi còn nhận
thấy, khi sử dụng enzyme cắt thì sản phẩm PCR được cắt không hoàn toàn, tức là xuất hiện 3 băng có kắch thước lần lượt khoảng 596bp, 358bp và 238bp. Điều này có thể do xuất hiện hiện tượng dị hợp tử trong các mẫu có xuất hiện biến đổi. 3.1.2. Kết quả giải trình tự trực tiếp và nhân dòng
Kết quả giải trình tự trực tiếp
Sau khi được tinh sạch, sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp với mồi xuôi của cặp mồi MP9.
Chúng tôi chọn 20 mẫu có biến đổi (khi phân tắch bằng PCR-RFLP thu được 2 băng 358bp và 238bp) để giải trình tự trực tiếp thì có 18 mẫu thấy xuất hiện dị hợp tử CT (có cả C và T tại cùng một vị trắ), còn hai mẫu chỉ xuất hiện đồng hợp tử TT (đây là mẫu mô u và mô lân cận u của cùng một bệnh nhân).
Sử dụng phần mềm BioEdit và Clustal X để phân tắch kết quả giải trình tự và sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự thu được với trình tự ADN
tham khảo của gen MMP-9 đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI (NG_011468.1), chúng tôi đã xác định được các vị trắ biến đổi trên gen MMP-9.
36
Hình 8: Hình ảnh kết quả giải trình tự trực tiếp
Hình a: Trường hợp dị hợp tử CT (Bệnh nhân mã 4841)
Hình b: Trường hợp đồng hợp tử TT (Bệnh nhân mã 38784)
Từ kết quả giải trình tự trực tiếp, so sánh với trình tự tham khảo trên ngân hàng gen đã được công bố trong NCBI, chúng tôi xác định được chắnh xác vị trắ
biến đổi C→T trên promoter gen MMP-9 của các bệnh nhân UTĐTT tại vị trắ -
1562. Vị trắ biến đổi này đã được một số nghiên cứu trên thế giới công bố như Peng và cs đã nghiên cứu, biến đối C-1562T là một đa hình trong vùng promoter
gen MMP-9 có vai trò nhất định đóng góp vào sự nhạy cảm di truyền của bệnh
ung thư dù có nghiên cứu cho rằng đa hình này không thể là một yếu tố chắnh gây nên nguy cơ của hầu hết các loại ung thư [31]. Đa hình này đã được phát hiện ở khá nhiều bệnh ung thư ở người như: ung thư vú [35], ung thư phổi [20], ung thu đại trực tràng [12], ung thu vòm mũi họng [1]ẦVới mỗi loại ung thư, ảnh hưởng của đa hình C-1562T là khác biệt nhưng nhìn chung, nó đều ảnh hưởng xấu đến quá trình điều trị và tiến triển bệnh của bệnh nhân.
Nhân dòng và giải trình tự
Với kết quả giải trình tự trực tiếp kết hợp với kết quả phân tắch PCR- RFLP, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên một mẫu có hiện tượng dị hợp tử để tiến hành nhân dòng và giải trình tự để khẳng định một lần nữa kết quả thu được từ phương pháp phân tắch PCR-RFLP.
37
Biến nạp
Hình 9: Hình ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid được biến nạp vào E. Coli DH5α
Sau khi tế bào khả biến được biến nạp và cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung thêm Ampicllin để qua đêm ở tủ ấm 37⁰C, thì những khuẩn lạc nào mọc trên đĩa thạch sẽ được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu MP9 (Hình 9). Nếu khi điện di kiểm tra sản phẩm PCR cho kắch thước đúng bằng kắch thước của đoạn gen 596bp được chèn vào thì chúng tôi tiếp tục sử dụng phương pháp RFLP để khẳng định mẫu đã chèn là các mẫu có chứa đột biến bằng cách sử
dụng enzyme SphI. Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt đều được điện di trên gel
agarose 1,7%, nhuộm EtBr và được quan sát dưới tia UV. Từ kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy rằng:
+ Sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc khi điện di thu được băng có kắch thước đúng bằng kắch thước của đoạn gen được biến nạp là vào khoảng 596 bp.
+ Sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc sau khi được cắt bằng enzyme
SphI thì trên bản điện di thu được kết quả: Xuất hiện hai băng có kắch thước
khoảng 358bp và 238bp đối với một khuẩn lạc, và xuất hiện một băng đối với một khuẩn lạc khác. Như vậy, chúng tôi đã thu nhận được một khuẩn lạc chứa biến đổi và một khuẩn lạc không chứa biến đổi.
Tinh sạch plasmid tái tổ hợp
Sau khi đã khẳng định được trong tế bào E.coli DH5α có chứa đoạn gen
38
sung Ampicillin qua đêm, từ 12-16 tiếng ở 37⁰C. Để tách plasmid chúng tôi sử dụng bộ kit QIA prep Mniprep Kit, sản phẩm thu được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, nhuộm EtBr và quan sát dưới tia UV bước sóng 245nm (Hình 10).
Hình 10: Hình ảnh điện di ADN plasmid được tách từ E.Coli DH5α
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Giếng 2: Plasmid được chèn đoạn gen không có biến đổi Giếng 3: Plasmid được chèn đoạn gen có biển đổi
Plasmid được điện di kiểm tra và đo nồng độ bằng máy đo Nano Drop để kiểm tra độ tinh sạch.
Qua hình ảnh điện di thấy các băng plasmid tương đối sáng, gọn chứng tỏ lượng ADN trong mẫu khá cao và sạch, đủ điều kiện để tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo.
Để khẳng định chắc chắn plasmid đã mang đoạn chèn có kắch thước khoảng 596bp mong muốn. Tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu MP9 và cặp mồi pJet1.2 với khuôn là plasmid. Điện di sản phẩm trên gel Agarose 1,7%, nhuộm EtBr, soi dưới tia UV và chụp ảnh (Hình 11).
39
Hình 11: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ plasmid và sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 2,5: Sản phẩm PCR với cặp mồi pJet1.2 Giếng 3,6: Sản phẩm PCR với cặp mồi MP9
Giếng 4, 7: Sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn từ sản phẩm PCR với cặp mồi MP9
Các băng lên rõ nét. Với sản phẩm PCR từ cặp mồi pJet1.2 băng có kắch thước lý thuyết khoảng 716bp, sản phẩm PCR từ cặp mồi MP9 có kắch thước lý thuyết khoảng 596bp. Khi tiến hành dùng enzyme giới hạn cắt sản phẩm PCR được nhân lên từ cặp mồi MP9 thì khuẩn lạc có plasmid mang đoạn chèn chứa biến đổi bị cắt hoàn toàn và tạo thành hai băng có kắch thước lý thuyết khoảng 358bp và 238bp (Hình 11 giếng 7). Còn khuẩn lạc có plasmid mang đoạn chèn không chứa biến đổi thì vẫn chỉ có một băng có kắch thước lý thuyết khoảng 596bp (Hình 11 giếng 4).
Kết quả giải trình tự plasmid mang đoạn gen chứa đột biến
Với plasmid chứa đoạn promoter gen MMP-9, chúng tôi đã giải trình tự 2
40
Hình 12: Kết quả phân tắch trình tự plasmid
Hình a: Mẫu không mang biến đổi -1562C Hình b: Mẫu mang biến đổi -1562T
Với kết quả giải trình tự, chúng tôi đã khẳng định chắc chắn đã chèn được đoạn gen có kắch thước 596bp vào plasmid. Đồng thời, tại vị trắ -1562 ở mẫu không có biến đổi là C, còn mẫu có biến đổi là T. Như vậy kết quả giải trình tự plasmid đã chỉ ra có xuất hiện biến đổi C thành T tại vị trắ -1562 phù hợp với kết quả phân tắch PCR-RFLP.
Sử dụng phần mềm BioEdit và ClustalX để phân tắch kết quả giải trình tự và sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự thu được với trình tự tham
khảo của gen MMP-9 đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI
(NG_011468.1), chúng tôi đã xác định được biến đổi trên đoạn promoter gen
MMP-9.
Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang biến đổi với trình tự tham khảo được biểu diễn ở hình 13.
41
Hình 13: Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang biến đổi với trình tự tham khảo sử dụng chương trình BLAST
Kết quả so sánh trình tự mẫu mang biến đổi với trình tự tham khảo được biểu diễn ở hình 14.
Hình 14: Kết quả so sánh trình tự mẫu mang biến đổi với trình tự tham khảo sử dụng chương trình BLAST
42
Kết quả so sánh thu được là phù hợp với kết quả PCR-RFLP và giải trình tự trực tiếp.
3.2. Kết quả phân tắch biến đổi ADN của gen MMP-9 từ mẫu máu
3.2.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen có chứa vị trắ biến đổi của promoter gen
MMP-9
Kiểm tra ADN tổng số từ mẫu máu của người bệnh và mẫu máu của người bình thường (người cho máu) bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, đồng thời, tiến hành đo độ hấp thụ của ADN tổng số để đánh giá độ tinh sạch cũng như lượng ADN bằng máy đo quang phổ Nano Drop, kết quả cho thấy lượng ADN trong mẫu thu được là khá sạch đủ điều kiện để tiến hành các thắ
nghiệm tiếp theo.
Khuếch đại đoạn ADN có kắch thước lý thuyết khoảng 596bp bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu MP9 từ khuôn là ADN tổng số tách từ mẫu máu bệnh, và mẫu máu thường. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7% nhuộm EtBr, quan sát dưới tia UV bước sóng 245nm. Kết quả điện di được thể hiện như trong hình 15.
Hình 15: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ mẫu máu thường và bệnh Giếng 4: Thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 1-3: Sản phẩm PCR từ mẫu máu người bình thường cho máu (mã 29079, 29085, 29093) Giếng 5-7: Sản phẩm PCR từ mẫu máu bệnh nhân UTĐTT (bệnh nhân mã 10626, 17401, 16689)
43
3.2.2. Kết quả phân tắch RFLP đoạn gen chứa biến đổi trong vùng
promoter gen MMP-9
Tương tự như mẫu mô, sau khi khuếch đại được đoạn ADN chứa vị trắ
biến đổi -1562, chúng tôi cũng tiến hành cắt sản phẩm PCR bằng enzyme SphI.
Như trong hình ảnh, nếu xuất hiện biến đổi C-1562T thì enzyme cắt sản phẩm PCR thành hai băng với kắch thước lý thuyết là 358bp và 238bp. Ngược lại nếu không xuất hiện biến đổi thì sản phẩm PCR không bị cắt và kắch thước lý thuyết bằng 596bp. Thực hiện ở mẫu máu của 14 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, chúng tôi phát hiện được 2 mẫu có chứa biến đổi C→T tại vị trắ -1562. Như vậy biến đổi C-1562T cũng xuất hiện ở mẫu máu người bệnh. Thực hiện ở mẫu máu của 30 người bình thường cho máu, chúng tôi phát hiện được 9 mẫu có chứa biến đổi C →T tại vị trắ -1562. Như vậy biến đổi C-1562T cũng xuất hiện ở mẫu máu của người khỏe mạnh. Hình ảnh kết quả cắt enzyme được thể hiện ở hình 16.
Hình 16: Hình ảnh cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR từ mẫu máu người bình thường cho máu và mẫu máu bệnh nhân UTĐTT
Giếng 1: Băng chuẩn ADN 100bp
Giếng 2-3: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme từ mẫu máu của người bình thường cho máu (mã 29093)
Giếng 4-5: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme từ mẫu máu của bệnh nhân mã 16756
44
Để đánh giá sự xuất hiện của biến đổi C-1562T trên các vị trắ mô khác nhau ở cùng một bệnh nhân UTĐTT, tiến hành nghiên cứu và phân tắch ADN ở mẫu mô lân cận u, mẫu mô u và mẫu máu của cùng một bệnh nhân. Kết quả được thể hiện ở hình 17.
Hình 17: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RE mẫu mô u-mô lân cận u và mẫu máu của cùng một bệnh nhân (mã 16678)
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp
G2-3: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzym của mẫu mô lân cận u G4-5: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme của mẫu mô u G6-7: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme của mẫu máu
Như trên hình 17, sản phẩm PCR từ mẫu mô lân cận u không bị cắt bằng enzyme, chỉ xuất hiện 1 băng có kắch thước khoảng 596bp, mẫu mô u được cắt tạo 2 băng với kắch thước khoảng 358bp và 238bp, còn mẫu máu thì cũng chỉ xuất hiện một băng với kắch thước khoảng 596bp. Như vậy, biến đổi chỉ xuất hiện ở mẫu mô u mà không xuất hiện ở mẫu mô lân cận u và mẫu máu. Từ kết quả này, chúng tôi dự đoán đây là biến đổi C-1562T có thể là biến đổi soma.
