Mẫu mô đại trực tràng bao gồm các mẫu mô u và mẫu mô lân cận u của cùng một bệnh nhân được lấy ra từ tủ -80⁰C, rã đông và rửa bằng đệm phosphate 100mM, pH7. Mẫu mô được cân với lượng tương đương 0,03-0,05g/mẫu và cho vào các ống li tâm riêng biệt.
Tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kắt tách chiết ADN tổng số từ mô Ờ Gene JET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific).
- Dùng kéo cắt nhỏ mẫu mô trong ống li tâm 1,5 ml. - Thêm vào mỗi ống li tâm:
+ 180 ộl Digestion Solution vào ống li tâm, trộn đều tạo dạng huyền phù. + 20 ộl Protein K Solution, trộn đều để tạo thể đồng nhất.
Ủ hỗn hợp trên ở 56⁰C cho đến khi mẫu mô được phân giải hoàn toàn, lắc đều trong quá trình ủ. Sau 3 giờ nếu quá trình thủy phân mẫu chưa hoàn toàn thì phải kéo dài thời gian ủ đến 6-8 giờ hoặc có thể qua đêm.
- Bổ sung 20 ộl Rnase Solution rồi ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung 200 ộl Lysis Solution, voltex 15 giây cho đến khi được thể đồng nhất. - Bổ sung 400 ộl Ethanol 50%, trộn nhẹ nhàng.
- Cho dịch lên cột, ly tâm 8000 vòng trong 1 phút. Sau đó chuyển sang ống 2ml mới của hãng.
- Cho 500 ộl Wash Buffer I, ly tâm 10000 vòng trong 1 phút, loại bỏ dịch. - Bổ sung 500 ộl Wash Buffer II, ly tâm ở tốc độ cao nhất khoảng 20000 vòng trong 3 phút.
Bỏ dịch và ly tâm thêm 1 phút cho hết hoàn toàn dịch. Chuyển cột sang ống li tâm 1,5ml mới.
- Thêm 200 ộl Elution Buffer vào trung tâm cột. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 10000 vòng trong 1 phút.
- Bảo quản dịch ADN vừa thu được ở -20⁰C
ADN tổng số sau khi được tách sẽ được kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di trên gel agarose 1% và đo nồng độ ADN bằng máy quang phổ Nano Drop.
24