Trên thế giới
Năm 2001, Minematsu cùng cs đã báo cáo về đa hình đơn nucleotide, nhóm tác giả đã nhận thấy có sự gia tăng về tần số alen T thay cho alen C tại vị
trắ -1562 của promoter trên gen MMP-9 ở những người dân Nhật Bản hút thuốc
và bị khắ phế thũng (Emphisema Ờ đây là một tình trạng trong đó các túi khắ trong phổi bị tổn thương và mở rộng, gây tình trạng khó thở) so với những người hút thuốc nhưng chưa bị mắc chứng khắ phế thũng. Nghiên cứu này của nhóm tác
giả đã chứng minh được rằng: Đa hình của MMP-9 có thể là một trong những
nguyên nhân gây chứng bệnh khắ phế thũng ở những người hút thuốc lâu năm [28].
Năm 2009, Sadeghi và cs đã tiến hành nghiên cứu đa hình vùng promoter
gen MMP-9 ở 180 bệnh nhân ung thư vú và 100 người khỏe mạnh ở Iran bằng
phương pháp PCR-RFLP. Nhóm tác giả đã phát hiện ra đa hình C-1562T ở vùng
20
bình thường là 91%, 9% và 0%; ở bệnh nhân ung thư vú đã xuất hiện di căn là 63,33%, 31,11%, 5,56%, bệnh nhân ung bị u xơ là 75,5%, 22,2%, 2,3%. Với bảng số liệu thu được, nhóm tác giả nhận thấy: Sự di căn của các hạch bạch huyết tăng cao đáng kể ở những bệnh nhân ung thư vú có mang alen T. Như vậy, đa hình C-1562T có liên quan đến sự xuất hiện và phát triển ung thư ở bệnh nhân ung thư vú Iran [35].
Ở Việt Nam
Năm 2012, Lê Thị Huyền Trang và cs đã tiến hành nghiên cứu đa hình
trên gen MMP-9 ở bệnh COPD. Nhóm tác giả đã xác định được đa hình C-1562T trên gen MMP-9 của 100 bệnh nhân COPD theo phương pháp giải trình tự gen.
Bệnh nhân được lấy máu và phân tắch giải trình tự gen tại phòng thắ nghiệm của Đại học Shiga Nhật Bản. Kết quả thu được: Tỉ lệ bệnh nhân COPD có alen T (C/T hay T/T) là 23%, bệnh nhân kiểu gen C/C là 77%. Phân độ nặng của COPD theo GOLD giai đoạn I, II, III, IV tương ứng là 8%, 37%, 48%, 7%. Tỉ lệ xuất
hiện đa hình ở MMP-9 của nghiên cứu cũng tương tự một số nghiên cứu của
Nhật và Trung Quốc. Trong số 23 bệnh nhân COPD có alen T, giai đoạn I là 13%, giai đoạn II là 30,4%, giai đoạn III là 47,8%, giai đoạn IV là 8,7%. Tuy nhiên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm có và không có alen T về mức độ nặng của COPD. Như vậy, nhóm tác giả đã phát hiện có đột biến
gen MMP-9 ở bệnh nhân COPD ở Việt Nam và tỉ lệ cũng tương tự như các
nghiên cứu của Nhật và Trung Quốc [2].
Có thể nói, ở Việt Nam, những nghiên cứu về đa hình nói riêng hay những
biến đổi vùng promoter gen MMP-9 còn rất sơ khai, trên đối tượng là bệnh nhân
ung thư đại trực tràng thì chưa có nghiên cứu nào. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành tập trung nghiên cứu về biến đổi ADN thuộc vùng
promoter gen MMP-9 trên đối tượng bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam.
Nghiên cứu thực hiện với mục đắch tìm được biến đổi trên vùng promoter gen
MMP-9 và mối liên quan giữa biến đổi với một số đặc điểm bệnh học của bệnh
UTĐTT, từ đó hỗ trợ cho việc chẩn đoán sớm, điều trị và tiên lượng của bệnh nhân UTĐTT hiệu quả hơn.
21
CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là mẫu mô và mẫu máu của bệnh nhân UTĐTT, mẫu máu của người bình thường. Mô được lấy tại vị trắ khối u và vị trắ lân cận u (cách khối u khoảng 5-10 cm). Trong nghiên cứu này sử dụng 99 mẫu mô và 14 mẫu máu của bệnh nhân UTĐTT do Khoa Tế bào - Giải phẫu bệnh, bệnh viện K và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức Ờ Hà Nội cung cấp. 30 mẫu máu của người bình thường cho máu (mẫu đối chứng) được lấy tại Khoa sàng lọc máu của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương. Mẫu mô và mẫu máu được đựng trong ống li tâm, vận chuyển từ bệnh viện về trong nitơ lỏng và bảo quản trong tủ lạnh sâu -80⁰C cho tới khi tiến hành những thắ nghiệm tiếp theo.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất chắnh sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê như trong bảng 4
Bảng 4: Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất Hãng cung cấp Mục đắch
Gene JET Genomic DNA Purification Kit Thermoscientific Tách ADN tổng số GeneJET Whole Blood Genomic DNA
Purification Mini Kit Thermoscientific Tách ADN tổng số
Agarose Invitrogen (Mỹ)
Điện di Acrylamide, Bis-Acrylamide Pharmacia (Thụy
Điển)
Mồi xuôi và mồi ngược IDT (Mỹ)
PCR Maxima Hot Start Mastermix 2X Thermoscientific
Enzyme Fastdigestệ SphI Fermentas (Đức) RFLP
Agar Merk (Đức)
Nuôi, cấy vi khuẩn
Pepton Fluka (Pháp)
Bacto Yeast Merk (Đức)
22
Một số hóa chất khác như: Axit Boric, Tris Ờ base, EDTA, Kali Phosphate, Ethanol, Natri Carbonat, Bạc Nitrat, Natriclorua, AmpicillinẦ được sử dụng trong nghiên cứu đều có độ sạch phân tắch.
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị và máy móc của Phòng thắ nghiệm Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thắ nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên được sử dụng trong nghiên cứu được thống kê trong bảng 5.
Bảng 5: Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Hãng sản xuất
1 Máy PCR (GeneAmp PCR system 9700) Applied BioSciences (Mỹ)
2 Nguồn điện di PowerPacỎ HC BioỜrad (Mỹ)
3 Bể điện di MiniỜSub Cell GT, MiniProtean 3 cell BioỜrad (Mỹ) 4 Máy ly tâm lạnh 5417R và máy ly tâm lạnh 19776 Eppendorf (Đức) 5 Tủ lạnh Ờ 20C và Ờ 80C Nuaire (Mỹ)
6 Bể ổn nhiệt ED5 Julabo (Đức)
7 Tủ an toàn sinh học Nuaire (Mỹ)
8 Máy làm khô chân không (Speed Vac) Thermo Electron (Mỹ) 9 Máy lắc ổn nhiệt (Thermostatic Shaker) Satorius Certomat
10 Tủ ổn nhiệt Sigma (Đức)
Ngoài ra, còn có các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân phân tắch, máy Voltex, máy Minispin, lò vi sóngẦ
2.2. Phương pháp tiến hành nghiên cứu
Để tiến hành phân tắch biến đổi ADN vùng promoter gen MMP-9, chúng
tôi thực hiện bằng phương pháp PCR-RFLP. Trước tiên, ADN tổng số được tách chiết từ mẫu mô và mẫu máu. Tiếp đó, đoạn ADN chứa biến đổi được nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sự có mặt của đoạn ADN sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di. Sản phẩm PCR được cắt bằng enzym giới hạn thắch hợp để nhận biết biến đổi qua phổ băng điện di. Đồng thời sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp. Để xác định chắnh xác biến đổi, đoạn gen chứa biến đổi được nhân dòng, giải trình tự để khẳng định kết quả.
23
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô
Mẫu mô đại trực tràng bao gồm các mẫu mô u và mẫu mô lân cận u của cùng một bệnh nhân được lấy ra từ tủ -80⁰C, rã đông và rửa bằng đệm phosphate 100mM, pH7. Mẫu mô được cân với lượng tương đương 0,03-0,05g/mẫu và cho vào các ống li tâm riêng biệt.
Tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kắt tách chiết ADN tổng số từ mô Ờ Gene JET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific).
- Dùng kéo cắt nhỏ mẫu mô trong ống li tâm 1,5 ml. - Thêm vào mỗi ống li tâm:
+ 180 ộl Digestion Solution vào ống li tâm, trộn đều tạo dạng huyền phù. + 20 ộl Protein K Solution, trộn đều để tạo thể đồng nhất.
Ủ hỗn hợp trên ở 56⁰C cho đến khi mẫu mô được phân giải hoàn toàn, lắc đều trong quá trình ủ. Sau 3 giờ nếu quá trình thủy phân mẫu chưa hoàn toàn thì phải kéo dài thời gian ủ đến 6-8 giờ hoặc có thể qua đêm.
- Bổ sung 20 ộl Rnase Solution rồi ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung 200 ộl Lysis Solution, voltex 15 giây cho đến khi được thể đồng nhất. - Bổ sung 400 ộl Ethanol 50%, trộn nhẹ nhàng.
- Cho dịch lên cột, ly tâm 8000 vòng trong 1 phút. Sau đó chuyển sang ống 2ml mới của hãng.
- Cho 500 ộl Wash Buffer I, ly tâm 10000 vòng trong 1 phút, loại bỏ dịch. - Bổ sung 500 ộl Wash Buffer II, ly tâm ở tốc độ cao nhất khoảng 20000 vòng trong 3 phút.
Bỏ dịch và ly tâm thêm 1 phút cho hết hoàn toàn dịch. Chuyển cột sang ống li tâm 1,5ml mới.
- Thêm 200 ộl Elution Buffer vào trung tâm cột. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 10000 vòng trong 1 phút.
- Bảo quản dịch ADN vừa thu được ở -20⁰C
ADN tổng số sau khi được tách sẽ được kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di trên gel agarose 1% và đo nồng độ ADN bằng máy quang phổ Nano Drop.
24
2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu
Mẫu máu (bệnh nhân UTĐTT, người bình thường cho máu) được lấy ra từ tủ -80⁰C, rã đông, lấy 200ộl cho vào ống li tâm.
Tiến hành tách chiết ADN tổng số bằng kit GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini KIT (Thermo Scientific) theo đúng quy trình của nhà sản xuất.
- Cho 20 ộl Protein K Solution vào ống li tâm đựng 200 ộl máu, trộn đều. - Bổ sung 400 ộl đệm Lysis Solution, trộn đều đến khi thu được dịch đồng nhất. - Ủ ở 56⁰C trong 10 phút, trong quá trình ủ phải thường xuyên trộn đều dung dịch đến khi tế bào được ly giải hoàn toàn.
- Bổ sung 200 ộl Ethanol (96-100%), trộn đều.
- Cho dịch lên cột, ly tâm 8000 vòng trong 1 phút. Loại bỏ dịch.
- Cho 500 ộl đệm rửa WBI (Wash Buffer I). Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút. Loại bỏ dịch.
- Cho 500 ộl đệm rửa WBII (Wash Buffer II). Ly tâm ở tốc độ tối đa khoảng 20000 vòng trong 3 phút. Loại bỏ dịch. Ly tâm thêm một lần nữa với tốc độ tối đa trong vòng 1 phút cho hết sạch dịch.
- Cho cột vào ống li tâm 1,5ml mới, sạch. Bổ sung 200ộl đệm Elution Buffer vào trung tâm màng cột. Ủ 2-5 phút ở nhiệt độ phòng rồi ly tâm với tốc độ 10000 vòng trong 1 phút.
- Bảo quản dịch ADN tổng số vừa thu được ở -20⁰C.
ADN tổng số sau khi tách sẽ được kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di trên gel agarose 1% và đo nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ Nano Drop.
2.2.3. Khuếch đại đoạn gen trên vùng promoter của gen MMP-9 bằng PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp) được Kary Mullis tìm ra đã giúp các nghiên cứu về ADN nói riêng và về sinh học phân tử nói chung đã đạt được nhiều thành tựu. Nhờ kỹ thuật này, một đoạn ADN bất kỳ trong genome được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nuleotide ở hai đầu đoạn ADN đó đã biết. Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sợi đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp ADN invitro nhờ enzyme
25
ADN polymerase. Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng ADN làm khuôn ban đầu rất nhỏ (cỡ 10-3 ộg). Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bước cơ bản: Biến tắnh (Denaturing), gắn mồi (Annealing) và tổng hợp (Extending).
Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR được chúng tôi thiết kế bằng chương trình Primer. Trình tự cặp mồi được trình bày ở bảng 6.
Bảng 6: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR
Tên mồi Trình tự mồi Kắch thước
sản phẩm (bp) MP9
F 5Ỗ-TTA TCT CCA TCT CAC AGT CTCA- 3Ỗ
596bp R 5Ỗ-GCC CTT TCA GTT CTC CAG-3Ỗ
Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần như trong bảng 7
Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tắch (l) Nồng độ cuối cùng
Master Mix 2x 6,25 1X
Primer F 10ộM 0,25 0,2 M
Primer R 10ộM 0,25 0,2 M
ADN khuôn Tùy nồng độ ADN
tổng số của mỗi mẫu 2,5ng Nước Bổ sung cho tổng
thể tắch đủ 12,5
Chu trình nhiệt đối với cặp mồi MP9, trong 35 chu kỳ như hình 4:
Hình 4: Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1,7%, nhuộm EtBr. Quan sát và chụp ảnh trên máy soi tử ngoại.
26
2.2.4. Phương pháp RFLP
Phương pháp RFLP sử dụng các enzyme giới hạn thắch hợp phân cắt sản phẩm PCR để nhận biết biến đổi qua phổ băng điện di.
Với đoạn ADN có chứa vị trắ -1562 trên vùng promoter gen MMP-9, chúng tôi sử dụng Enzyme FastDigestệ SphI. Enzyme này có vị trắ nhận biết trên
ADN như sau:
5ỖẦGCATG/CẦ3Ỗ 3ỖẦC/GTACGẦ5Ỗ
Khi phân tắch vị trắ nhận biết của enzyme giới hạn trên đoạn ADN có kắch thước 596bp, chúng tôi nhận thấy: Trong trường hợp -1562C thì đoạn ADN
không bị enzyme SphI cắt và sản phẩm có kắch thước là 596bp, trong trường hợp -1562T thì đoạn ADN bị enzyme ShpI cắt tại 1 vị trắ duy nhất tạo 2 đoạn ADN có
kắch thước lần lượt là 358bp và 238bp.
Sản phẩm PCR được tiến hành phản ứng cắt với enzyme thắch hợp theo
hướng dẫn của nhà sản xuất. Thành phần phản ứng cắt enzyme SphI được trình
bày ở bảng 8
Bảng 8: Thành phẩn phản ứng cắt sử dụng enzyme giới hạn SphI
Thành phần Thể tắch
10X FastDigestệ buffer 2ộl Sản phẩm PCR (~0.2 ộg) 10ộl
FastDigestệ enzym SphI 1ộl
Nước Bổ sung đến đủ 30 ộl
Thành phần phản ứng sau khi được trộn đều và ly tâm nhẹ sẽ được ủ ở 37⁰C trong bể ổn nhiệt 15 phút, bất hoạt enzyme ở 65⁰C. Sản phẩm sau khi cắt sẽ được tiến hành điện di kiểm tra trên gel Agarose 1,7% và được nhuộm EtBr, được quan sát và chụp ảnh trên máy soi tử ngoại.
2.2.5. Điện di
Điện di là một trong số các phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu hóa sinh để nhằm mục đắch phân tách các hợp chất. Ngoài ra điện di có thể dùng trong đánh giá độ tinh sạch hay nhận dạng một số hợp chất quan tâm.
27
Điện di gel agarose được thực hiện với chất nền là agarose. Nồng độ agarose dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5 Ờ 2,5%. Nồng độ gel cao hay thấp hơn giới hạn này là rất khó thao tác vì gel hoặc quá mềm, hoặc quá rắn.
Chuẩn bị bản gel 1% để: Kiểm tra ADN tổng số, kiểm tra sản phẩm PCR, tinh sạch ADNẦ
- Cân 1 g Agarose dạng bột (invitrogen), bổ sung thêm 100 ml đệm chạy TBE 1X pH 8,3 (Tris-base 0,09M; axit boric 0,09M, EDTA 4mM).
- Cho vào lò vi sóng đun cho đến khi agarose tan hoàn toàn, tạo thể dịch thống nhất.
- Để nguội đến khoảng 60⁰C và đổ vào bể điện di có cài sẵn lược. - Sau 30-40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra.
- Sản phẩm cần điện di kiểm tra sẽ được trộn với loading dye với tỷ lệ thắch hợp và được tra lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110V trong khoảng thời gian thắch hợp (kiểm tra sản phẩm PCR khoảng 30 phút, kiểm tra ADN tổng số khoảng 60 phút).
- Sau khi điện di xong nhẹ nhàng lấy bản gel ra khỏi bể điện di, ngâm vào dung dịch EtBr trong 20-30 phút và quan sát dưới tia UV.
2.2.6. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR cần tinh sạch để giải trình tự. Phản ứng PCR được tiến hành với thể tắch lớn 75 ộl, sau đó sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và nhuộm bằng EtBr. Quan sát và cắt băng sản phẩm PCR trên máy soi gel.
Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit thôi gel QIAquickệ Gel Extraction Kit theo đúng quy trình của nhà sản xuất.
- Cắt băng sản phẩm PCR ra khỏi bản gel agarose bằng dao sạch và sắc, bỏ vào ống li tâm 1,5 ml mới.
- Cân khối lượng mảnh gel vừa cắt (khối lượng mảnh gel nên nhỏ hơn 0,4g). Bổ sung 3 lần thể tắch đệm QG vào ống mẫu với 1 thể tắch gel (tỷ lệ 0,1 g ~ 100 ộl QG).
- Ủ ở 50⁰C trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lại trộn đều ống mẫu để mảnh gel tan hoàn toàn. Sau khi mảnh gel đã tan hoàn toàn, quan sát màu sắc của dịch