Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp) được Kary Mullis tìm ra đã giúp các nghiên cứu về ADN nói riêng và về sinh học phân tử nói chung đã đạt được nhiều thành tựu. Nhờ kỹ thuật này, một đoạn ADN bất kỳ trong genome được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nuleotide ở hai đầu đoạn ADN đó đã biết. Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sợi đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp ADN invitro nhờ enzyme
25
ADN polymerase. Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng ADN làm khuôn ban đầu rất nhỏ (cỡ 10-3 ộg). Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bước cơ bản: Biến tắnh (Denaturing), gắn mồi (Annealing) và tổng hợp (Extending).
Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR được chúng tôi thiết kế bằng chương trình Primer. Trình tự cặp mồi được trình bày ở bảng 6.
Bảng 6: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR
Tên mồi Trình tự mồi Kắch thước
sản phẩm (bp) MP9
F 5Ỗ-TTA TCT CCA TCT CAC AGT CTCA- 3Ỗ
596bp R 5Ỗ-GCC CTT TCA GTT CTC CAG-3Ỗ
Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần như trong bảng 7
Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tắch (l) Nồng độ cuối cùng
Master Mix 2x 6,25 1X
Primer F 10ộM 0,25 0,2 M
Primer R 10ộM 0,25 0,2 M
ADN khuôn Tùy nồng độ ADN
tổng số của mỗi mẫu 2,5ng Nước Bổ sung cho tổng
thể tắch đủ 12,5
Chu trình nhiệt đối với cặp mồi MP9, trong 35 chu kỳ như hình 4:
Hình 4: Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1,7%, nhuộm EtBr. Quan sát và chụp ảnh trên máy soi tử ngoại.
26
2.2.4. Phương pháp RFLP
Phương pháp RFLP sử dụng các enzyme giới hạn thắch hợp phân cắt sản phẩm PCR để nhận biết biến đổi qua phổ băng điện di.
Với đoạn ADN có chứa vị trắ -1562 trên vùng promoter gen MMP-9, chúng tôi sử dụng Enzyme FastDigestệ SphI. Enzyme này có vị trắ nhận biết trên
ADN như sau:
5ỖẦGCATG/CẦ3Ỗ 3ỖẦC/GTACGẦ5Ỗ
Khi phân tắch vị trắ nhận biết của enzyme giới hạn trên đoạn ADN có kắch thước 596bp, chúng tôi nhận thấy: Trong trường hợp -1562C thì đoạn ADN
không bị enzyme SphI cắt và sản phẩm có kắch thước là 596bp, trong trường hợp -1562T thì đoạn ADN bị enzyme ShpI cắt tại 1 vị trắ duy nhất tạo 2 đoạn ADN có
kắch thước lần lượt là 358bp và 238bp.
Sản phẩm PCR được tiến hành phản ứng cắt với enzyme thắch hợp theo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hướng dẫn của nhà sản xuất. Thành phần phản ứng cắt enzyme SphI được trình
bày ở bảng 8
Bảng 8: Thành phẩn phản ứng cắt sử dụng enzyme giới hạn SphI
Thành phần Thể tắch
10X FastDigestệ buffer 2ộl Sản phẩm PCR (~0.2 ộg) 10ộl
FastDigestệ enzym SphI 1ộl
Nước Bổ sung đến đủ 30 ộl
Thành phần phản ứng sau khi được trộn đều và ly tâm nhẹ sẽ được ủ ở 37⁰C trong bể ổn nhiệt 15 phút, bất hoạt enzyme ở 65⁰C. Sản phẩm sau khi cắt sẽ được tiến hành điện di kiểm tra trên gel Agarose 1,7% và được nhuộm EtBr, được quan sát và chụp ảnh trên máy soi tử ngoại.
2.2.5. Điện di
Điện di là một trong số các phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu hóa sinh để nhằm mục đắch phân tách các hợp chất. Ngoài ra điện di có thể dùng trong đánh giá độ tinh sạch hay nhận dạng một số hợp chất quan tâm.
27
Điện di gel agarose được thực hiện với chất nền là agarose. Nồng độ agarose dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5 Ờ 2,5%. Nồng độ gel cao hay thấp hơn giới hạn này là rất khó thao tác vì gel hoặc quá mềm, hoặc quá rắn.
Chuẩn bị bản gel 1% để: Kiểm tra ADN tổng số, kiểm tra sản phẩm PCR, tinh sạch ADNẦ
- Cân 1 g Agarose dạng bột (invitrogen), bổ sung thêm 100 ml đệm chạy TBE 1X pH 8,3 (Tris-base 0,09M; axit boric 0,09M, EDTA 4mM).
- Cho vào lò vi sóng đun cho đến khi agarose tan hoàn toàn, tạo thể dịch thống nhất.
- Để nguội đến khoảng 60⁰C và đổ vào bể điện di có cài sẵn lược. - Sau 30-40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra.
- Sản phẩm cần điện di kiểm tra sẽ được trộn với loading dye với tỷ lệ thắch hợp và được tra lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110V trong khoảng thời gian thắch hợp (kiểm tra sản phẩm PCR khoảng 30 phút, kiểm tra ADN tổng số khoảng 60 phút).
- Sau khi điện di xong nhẹ nhàng lấy bản gel ra khỏi bể điện di, ngâm vào dung dịch EtBr trong 20-30 phút và quan sát dưới tia UV.
2.2.6. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR cần tinh sạch để giải trình tự. Phản ứng PCR được tiến hành với thể tắch lớn 75 ộl, sau đó sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và nhuộm bằng EtBr. Quan sát và cắt băng sản phẩm PCR trên máy soi gel.
Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit thôi gel QIAquickệ Gel Extraction Kit theo đúng quy trình của nhà sản xuất.
- Cắt băng sản phẩm PCR ra khỏi bản gel agarose bằng dao sạch và sắc, bỏ vào ống li tâm 1,5 ml mới.
- Cân khối lượng mảnh gel vừa cắt (khối lượng mảnh gel nên nhỏ hơn 0,4g). Bổ sung 3 lần thể tắch đệm QG vào ống mẫu với 1 thể tắch gel (tỷ lệ 0,1 g ~ 100 ộl QG).
- Ủ ở 50⁰C trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lại trộn đều ống mẫu để mảnh gel tan hoàn toàn. Sau khi mảnh gel đã tan hoàn toàn, quan sát màu sắc của dịch trong ống, dịch phải có màu vàng tương tự như màu của đệm QG. Nếu dịch có
28
màu cam hoặc màu tắm thì bổ sung 10 ộl 3M Sodium acetate, pH 5,0, trộn đều cho đến khi dịch có màu vàng.
- Thêm 1 thể tắch isopropanol vào ống mẫu và trộn đều.
- Cho dịch lên cột ly tâm 13000 vòng trong 1 phút, bỏ dịch. Nếu mẫu có thể tắch lớn hơn 800 ộl thì phải lên cột nhiều lần, cho đến khi hết dịch trong ống mẫu.
- Bổ sung 500 ộl đệm QG vào cột , ly tâm 13000 vòng trong 1 phút. Bỏ dịch. - Rửa cột: Cho 750 đệm PE vào cột, để 2-5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm 13000 vòng trong 1 phút. Bỏ dịch rồi ly tâm lại một lần nữa cho hết sạch dịch trên cột.
- Cho cột sang ống li tâm 1,5ml mới, sạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cho 50 ộl đệm Elution Buffer vào trung tâm màng cột để thôi ADN ra khỏi cột, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 13000 vòng trong 1 phút.
- Bảo quản ADN tinh sạch vừa thu được ở -20⁰C
Kiểm tra độ tinh sạch của ADN bằng điện di và đo nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ Nano Drop.
2.2.7. Giải trình tự trực tiếp
Từ những năm 1970, trình tự các nucleotide trên phân tử ADN được xác định một cách đơn giản và nhanh chóng nhờ sự ra đời cả hai phương pháp khác nhau: Phương pháp hóa học và phương pháp enzyme. Tuy nhiên từ những năm cuối của thập kỷ 20 thế kỷ XX, trình tự nucleotide được xác định trên máy đọc tự động ngày càng phổ biến. Trên các máy đọc tự động hiện đại, thông thường bốn loại nucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau. Đầu đọc laser trong máy sẽ kắch hoạt các chất này khiến chúng hấp thụ và phát ra các màu, mỗi màu ứng với một loại nucleotide và được hiển thị bằng một đỉnh. Ưu điểm của phương pháp này là kết quả đọc được đưa trực tiếp vào chương trình máy tắnh, giảm bớt các sai sót do đọc bằng mắt gây ra.
2.2.8. Nhân dòng phân tử
Nhân dòng phân tử là một nhóm các phương pháp nhằm:
- Phân lập một đoạn ADN đặc hiệu từ một hỗn hợp các phân tử ADN ban đầu được tách chiết từ các mẫu sinh học có thành phần phức tạp.
29
- Nhân bản đoạn trình tự ADN được quan tâm lên một lượng đủ lớn để có thể tiến hành phân tắch về cấu trúc và chức năng ADN tương ứng.
Tiến hành: Sử dụng CloneJET PCR Cloning Kit 2.2.8.1. Cài ADN vào vector Pjet 1.2
Tiến hành phản ứng nối trên đá
Bảng 9: Thành phần phản ứng tạo đầu bằng
Thành phần Thể tắch
2X Reaction buffer 5ộl
Sản phẩm PCR 0.5ộl
Nýớc 3ộl
Enzym tạo đầu bằng 0.5ộl
Tổng thể tắch 9ộl
Trộn đều hỗn hợp, ủ hỗn hợp phản ứng ở 70⁰C trong 5 phút. Thực hiện phản ứng nối trên đá, bổ sung vào hỗn hợp các thành phần như trong bảng 10.
Bảng 10: Thành phần phản ứng chèn sản phẩm PCR vào vector
Thành phần Thể tắch
Sản phẩm PCR đã tạo đầu bằng 9 ộl pJET1.2/blunt Cloning Vector (50
ng/ộl) 0.5ộl
T4 ADN ligase 0.5 ộl
Tổng thể tắch 10ộl
Ủ hỗn hợp nối ở nhiệt độ phòng 22⁰C trong 5 phút.
2.2.8.2. Biến nạp vector Pjet1.2 vào vi khuẩn E.coli DH5α
Biến nạp gen là bước quan trọng trong ứng dụng nhân dòng sản xuất nhiều bản sao giống nhau từ một gen ỘđắchỢ (gen mong muốn nhân dòng). Vector nhân dòng phải thỏa mãn các điều kiện: có tâm tái bản, có gen chọn lọc, có vị trắ đa điểm chứa vị trắ cắt của nhiều enzym giới hạn. Các vector được biến nạp vào tế bào khả biến để nhân lên nhiều bản sao của vector đó. Tế bào nhận vector được gọi là biến nạp. Thể biến nạp được phát hiện nhờ sự biểu hiện của các gen chứa trong vector đó, thường là các gen kháng kháng sinh. Bên cạnh gen chọn lọc thể biến nạp, các vector plasmid được thiết kế thêm các gen sàng lọc.
30 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chúng tôi tiến hành biến nạp plasmid pJET 1.2 chèn đoạn ADN có kắch thước
596bp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Các tế bào được nhận plasmid sẽ mọc
thành khuẩn lạc trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Ampicillin. Các tế bào không có plasmid sẽ không sinh trưởng được trên môi trường này.
Vector plasmid pJET 1.2 có kắch thước 2974bp. Vị trắ đa điểm của vector được thiết kế nằm trong gen mã hóa cho một protein gây độc cho vi khuẩn (Hình 5).
Hình 5: Vector plasmid pJET1.2 [57]
Phương pháp biến nạp được tiến hành như sau:
- Lấy tế bào khả biến vi khuẩn E.Coli DH5α từ -80⁰C, để trên đá 5 phút cho hỗn hợp trong ống thành dạng lỏng.
- Bổ sung 5ộL hỗn hợp nối (ligate). Dùng ngón tay đập nhẹ vào thành ống để trộn đều plasmid và tế bào khả biến. Để ống trong đá khoảng 15 phút.
- Sốc nhiệt hỗn hợp ở 42⁰C trong 45 giây, để lại trên đá 3 phút.
- Bổ sung 1 ml môi trường LB, ủ 370C trong 15 phút, lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 1 giờ.
- Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, 3000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ 900 ộl dịch phắa trên.
- Hòa tan phần tủa bằng 100ộl dung dịch còn lại và trải trên đĩa thạch LB có bổ sung ampicillin (50ộg/ml).
31
2.2.8.3. Sàng lọc khuẩn lạc bằng PCR và RFLP
Sau khi tế bào khả biến được biến nạp và cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung Ampicillin để qua đêm ở tủ ấm 370C, những khuẩn lạc nào mọc trên đĩa thạch sẽ được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi MP9 (Bảng 11) hoặc với cặp mồi pJet1.2 (Bảng 12) để nhân đúng kắch thước đoạn gen cần biến nạp có trong tế bào vi khuẩn. Nếu PCR khuẩn lạc, sản phẩm được điện di cho băng kắch
thước 596bp thì chứng tỏ đã biến nạp thành công đoạn gen vào tế bảo E.coli
DH5α.
Bảng 11: Thành phần mỗi phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi MP9 Thành phần Thể tắch (l) Nồng độ cuối cùng
Master Mix 2x 6,25 1X
Primer F 10ộM 0,25 0,2 M
Primer R 10ộM 0,25 0,2 M
Nước 5,75
Trộn đều hỗn hợp, cho 1 khuẩn lạc vào hỗn hợp trộn đều. Chạy PCR với 35 chu kỳ, chu trình nhiệt đã được thể hiện ở hình 4.
Bảng 12: Thành phần mỗi phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi pJet1.2 Thành phần Thể tắch (l) Nồng độ cuối cùng
Master Mix 2x 6,25 1X
Primer F 10ộM 0,25 0,2 M
Primer R 10ộM 0,25 0,2 M
Nước 5,75
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7%, nhuộm EtBr và được nhận biết bằng tia UV bước sóng 245nm
2.2.8.4. Tách chiết plasmid (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tách chiết và tinh sạch ADN plasmid là một bước thắ nghiệm quan trọng trong các nghiên cứu nhân dòng phân tử cũng như trong hàng loạt nghiên cứu khác của lĩnh vực sinh học phân tử. Các plasmid thường được tinh sạch từ môi trường nuôi cấy dịch thể được chuẩn bị bằng cách nuôi cấy một khuẩn lạc đơn mang plasmid (thể biến nạp). Có rất nhiều phương pháp được sử dụng hiện nay
32
để tách chiết ADN plamid. Phương pháp dưới đây cho phép thu nhận chế phẩm ADN plamid ở dạng tương đối sạch. Nguyên lý của phương pháp này dựa vào lợi thế của việc biến tắnh bằng kiềm đối với ADN plasmid và ADN nhân và sự hồi tắnh một cách chọn lọc ADN plasmid sau khi trung hòa dung dịch. ADN được tách chiết có thể được sử dụng trong các phản ứng cắt bằng enzym giới hạn, nhân dòng và đọc trình tự.
Tiến hành tách plasmid: Sử dụng bộ kit QIA prep Miniprep kit, thực hiện ở nhiệt độ phòng. Các bước tiến hành:
- Lấy 1 khuẩn lạc đã được kiểm tra bằng PCR có chứa đoạn chèn trên đĩa thạch cho vào 1-5ml môi trường LB lỏng có chứa ampicillin. Lắc nuôi cấy qua đêm 12-16h ở 370C. Sau đó:
- Thu cặn tế bào: Ly tâm 8000 vòng/phút, 3 phút, loại bỏ dịch nổi, thu cặn. - Hòa cặn trong 250ộl dung dịch P1, vortex nhẹ.
- Thêm 250ộl dung dịch P2 đảo nhẹ, không để quá 2 phút.
- Thêm 350ộl dung dịch N3 đảo nhẹ, ly tâm 13000 vòng/phút, 10 phút, thu được tủa.
- Hút dịch cho lên cột, ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột.
- Thêm 0,75ml dung dịch PE và ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột.
- Thu ADN: Đặt cột lên ống li tâm 1,5ml mới. Cho 100ộl dung dịch EB lên cột, để cột đứng yên 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút. Thu dịch.
- Điện di kiểm tra dịch thu được trên gel agarose 0,8%. 2.2.9. Xử lý số liệu và tắnh toán thống kê
Xử lý các số liệu, kết quả thu được theo các phương pháp thống kê thường dùng. So sánh các đặc trưng thống kê mẫu bằng phép thử χỗ với mức ý nghĩa α = 0,05.
Trình tự promoter gen MMP-9 đã được so sánh, phân tắch với trình tự gen
MMP-9 đã được công bố trên các Ngân hàng trình tự gen Quốc tế EMBL (EBI)/Genbank/ DDBJ bằng các phần mềm tin sinh học chuyên dụng như BioEdit, BLAST, ClustalXẦ
33
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân tắch biến đổi gen MMP-9 từ mẫu mô của bệnh nhân UTĐTT
3.1.1. Kết quả phân tắch biến đổi của gen MMP-9 bằng kỹ thuật PCR-RFLP
Sau khi điện di kiểm tra ADN tổng số trên gel Agarose 1%, chúng tôi nhận thấy các băng ADN tổng số tương đối sáng, gọn. Đồng thời, khi tiến hành đo độ hấp thụ ánh sáng tia tử ngoại của ADN tổng số để đánh giá độ tinh sạch cũng như lượng ADN bằng máy đo quang phổ Nano Drop. Kết quả cho thấy các mẫu ADN đều có chỉ số A260/ A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0. Chứng tỏ lượng ADN trong mẫu thu được là sạch đủ điều kiện để tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo.
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu MP9 với khuôn là ADN tổng số được tách từ mô, khuếch đại đoạn gen có kắch thước lý thuyết 596bp bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7% nhuộm EtBr, quan sát dưới tia UV bước sóng 245nm. Kết quả điện di được thể hiện như trong hình 6.
Hình 6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR promoter gen MMP-9 từ ADN tổng số tách từ mô