M Ở ĐẦU
3.1.2. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử lectin bằng phương
Tiến hành chạy điện di các dịch protein thu được qua từng bước tinh sạch trên gel polyacrylamide nồng độ 12,5% với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V. Thang protein chuẩn là những protein có trọng lượng phân tử từ 6500 đến 116000 Da. Các
bước tiến hành chạy điện di được trình bày ở mục 2.3.5. Kết quảthu được như sau:
Hình 3.2. Kết quảđiện di protein lectin từ rong đỏ K. alvarezii qua từng bước tinh sạch
Trong đó:
Giếng 1: Thang chuẩn protein Giếng 2: DC thô
Giếng 3: Chế phẩm lectin sau thẩm tách
Giếng 4: Chế phẩm qua sắc ký lọc gel (peak II phân đoạn 18 đến 23) Giếng 5: Phân đoạn 20
Giếng 6: Phân đoạn 20 + chất khử 2-mercaptoethanol
Từ kết quả điện di trên gel và công thức tính trọng lượng phân tử của protein mục 3.1.1, có thểxác định được trọng lượng phân tửprotein lectin qua các bước tinh sạch.
Bảng 3.2. Trọng lượng phân tử lectin từ rong đỏ K. alvarezii qua các bước tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE
Giếng Mẫu Vạch 1 Vạch 2 Vạch 3
2 Dịch chiết thô - Chỉ lấy
band đậm 54819 (Da) 28318(Da) 18859(Da)
3 Chế phẩm lectin sau thẩm
tách 54819(Da) 28318(Da) 18859(Da)
4 Chế phẩm qua sắc ký lọc gel (peak II phân
đoạn 18 đến 23)
54819(Da) 28318(Da) _
5 Giếng 5 (phân đoạn 20) 28318(Da) _ _
6 Giếng 6 (phân đoạn 20 +
2-mercaptoethanol) 28318(Da)
_ _
Kết quả điện di từ hình 3.2 và bảng 3.2 cho thấy: sau mỗi bước tinh sạch, các protein tạp trong DC đã được loại bỏ đáng kể. So với giếng số 2, các vạch protein ở
giếng số 3 có màu đậm hơn và chỉ xuất hiện ở 3 vị trí (54,819; 28,318; 18,859 kDa),
trong đó vạch thứ 2 (ở vị trí 28,318 kDa) thể hiện rõ nhất. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả sắc ký đồ với nhựa Sephacryl S-200 khi ở đây xuất hiện lần lượt 2 peak,
trong đó peak thứ 2 có nồng độprotein cao hơn rất nhiều so với peak 1.
Ở giếng số 4, chỉ xuất hiện 2 vạch ở vị trí 54,819 và 28,318 kDa, trong đó vạch protein thứ 2 có khối lượng khoảng 28,318 kDa được nhận biết là của lectin, vì nó thể
hiện hoạt độ NKHC một cách rõ rệt nhất (hình 3.1). Trong khi đó, vạch ở vị trí 54,819 kDa lại rất mờ, đây có thể là do sự lẫn tạp protein từ peak số 1 sang trong quá trình phân tách protein của sắc ký lọc gel.
Giếng số 5 và số 6 lần lượt là kết quả điện di của phân đoạn 20 không có chất khửvà phân đoạn 20 có bổ sung chất khử 2-mercaptoethanol. Tuy nhiên, kết quả cho thấy, cả 2 giếng này đều chỉ xuất hiện một vạch duy nhất ở cùng một vị trí (28,318 kDa), do vậy có thể nói lectin của rong K. alvarezii đã được phân tách ra khỏi DC, có trọng lượng phân tử xấp xỉ 28,318 kDa và phân tử này tồn tại ở dạng đơn phân.
Kết quả thực nghiệm của chúng tôi cho thấy sựtương đồng cao đối với nghiên cứu của Rogers và cộng sựnăm 1991 [63] khi cho rằng, lectin từ rong biển thường có
trọng lượng phân tử thấp, khoảng từ 12 – 43kDa. Theo nghiên cứu của Kawakubo năm
1997 và 1999 [37, 38], lectin từ rong Eucheuma serra và E. amakusaensis cũng là những protein dạng monomer, có khối lượng phân tử xấp xỉ 29000Da. Ngoài ra, kết quả nghiên của của TS. Lê Đình Hùng và cộng sự năm 2011 về rong Kappaphycus alvarezii và E. denticulatum cũng cho thấy lectin của chúng có trọng lượng khoảng 28000 Da và tồn tại ở dạng monomer.
Mặt khác nghiên cứu của TS. Lê Đình Hùng và ctv cũng cho thấy, cũng giống
như lectin từ vi khuẩn hầu hết các lectin từ rong biển đều ở dạng monomer và có trọng
lượng phân tử thấp. Trong khi đó lectin từ thực vật bậc cao lại được tạo thành từ sự
gắn kết của 2 cho đến 4 monomer khác nhau và thường có trọng lượng phân tử lớn
hơn, dao động từ50000 đến 700000 Da [34].