M Ở ĐẦU
2.3.5. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương
pháp điện di SDS-PAGE [39]
Nguyên tắc
Điện di là sự dịch chuyển các chất có điện tích trong điện trường, tốc độ dịch chuyển phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của chất đó.
SDS- PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein
được xử lý với SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol. Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cảcác protein đều được tích điện âm. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ còn phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích
thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta
thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tửkhác nhau đã biết.
Đổ gel
Gel phân tách 12,5% (Separating gel)
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch:
Acrylamide/Bis (15,5:1) 3,8 mL Tris – HCl 3M; pH 8.8; 0,8 % SDS 5 mL Glycerine 2 g Nước cất 4,2 mL APS 10% 50 µL TEMED 5 µL
Sau khi cho TEMED vào, khuấy nhẹ, tiến hành đổ gel (tránh tạo bọt khí). Sau
đó nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp mặt gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 2 giờ).
Stacking gel
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch khác:
Acrylamide/Bis (15,5:1) 1 mL
Tris – HCl 3M; pH 6,8; 0,8 % SDS 3,1 mL
Nước cất 8,4 mL
APS 10% 100 µL
TEMED 10 µL
Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đỗ hết nước bên trên. Tiến hành đỗ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn.
Đồng thời đưa lược vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn
gel). Sau khi gel trùng ngưng, tháo lược, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung dịch điện di vào buồng điện di.
Tiến hành chạy điện di
Cho 20µl dung dịch mẫu cần kiểm tra vào các giếng. Tiến hành chạy điện di
với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V. Quá trình điện di kết thúc dựa vào sự
dịch chuyển của vạch màu xanh (bromophenol) khi cách đáy gel khoảng 1 cm.
Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue R- 250, trong 30 phút. Sau đó cho tiến hành tẩy màu bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm (hỗn hợp methanol: acid acetic: nước). Protein sẽđược phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.
Xác định trọng lượng phân tử của protein
Đo khoảng cách di chuyển của các băng protein từ gel phân tách tới các băng protein và khoảng cách từ gel phân tách tới vạch màu bromophenol (vạch màu cuối
cùng).
Tính giá trị Rf.
Rf = Khoảng cách di chuyển của protein lectin
Khoảng cách từgel phân tách đến dung môi (vạch màu Brommophenol)
Trọng lượng phân tử của các vạch protein có thể xác định thông qua giá trị Rf
trên, nhờphương pháp ngoại suy theo đồ thị.
Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của từng vạch protein. Kết quả được trình bày trong bảng PL 2. Từđó, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lgM (lg trọng lượng phân tử) của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel.
Hình 2.4. Đồ thịtương quan giữa lgM và Rf của protein trong thang chuẩn
Phương trình hồi quy tuyến tính thu được từ hình 2.4:
Y = -1,369x + 5,092
R2 = 0,985
Trong đó:
Y: là lgM (lg trọng lượng phân tử).
x: là Rf (tỷ số khoảng cách di chuyển của protein và vạch màu cuối cùng tính từ
gel phân tách).
Từ phương trình hồi quy tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lượng phân tử của protein theo công thức sau:
M = 10y
Trong đó:
M: là trọng lượng phân tử(đơn vị: Da)
y: là lgM