M Ở ĐẦU
2.3.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các tác nhân: nhiệt độ, pH đến hoạt
tính NKHC của lectin từ rong K. alvarezii[34] a. Ảnh hưởng của nhiệt độ
y = -1.369x + 5.092 R² = 0.985 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Lg M Rf
Cho 0,5-1 ml mẫu dung dịch lectin đun nóng tại những nhiệt độ khác nhau: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100(0C) trong 30 phút, sau đó làm lạnh ngay trong đá và đo
lại hoạt tính NKHC đểxác định ảnh hưởng của nhiệt độđế hoạt tính NKHC của lectin từ rong K. alvarezii.
b. Ảnh hưởng của pH
Cho 0,5 đến 1 ml mẫu dung dịch lectin thẩm tách với dung dịch đệm ở nhiệt độ
phòng, qua đêm với các mức pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Sau đó, thẩm tách
ngược lại với NaCl 0,85%.
Phần dịch trong túi thẩm tách được thu lại và thử hoạt tính NKHC để xác định
ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong K. alvarezii.
Những dung dịch đệm được sử dụng:
Đệm acetate pH: 3, 4, 5 Acitic acid/ acetate natri
Đệm phosphate pH: 6, 7 Na2HPO4.12H2O/ NaH2PO4.2H2O
Đệm tris HCl pH: 8 Tris/HCl
Đệm cacbonate pH: 9, 10 Na2CO3/NaHCO3
2.3.7. Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn của lectin từ rong K.
alvarezii
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của lectin từ rong K. alvarezii bằng phương
pháp khuếch tán trên giếng thạch.
Tiến hành
- Chuẩn bị dịch huyền phù của vi khuẩn đã được nuôi cấy qua 24 giờ với mật độ
khoảng 109 tế bào/mL. Trải dịch huyền phù vi khuẩn lên môi trường thạch trong đĩa
petri.
- Sử dụng thanh kim loại vô trùng để tạo thành những giếng nhỏ có đường kính khoảng 5mm trên bề mặt môi trường thạch.
- Nhỏ một lượng lectin nhất định vào mỗi giếng của đĩa thạch. Hoạt chất lectin sẽ
khuếch tán trên môi trường thạch, ức chế sựsinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, tạo vòng vô khuẩn.
- Ủ đĩa ở 370C. Sau 24 giờ, kiểm tra sự tạo thành vòng vô khuẩn, đo đường kính vòng vô khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tùy thuộc vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ.
Vi khuẩn thí nghiệm
Bảng 2.1. Các vi khuẩn dùng trong thí nghiệm khảo sát hoạt độ kháng khuẩn của lectin từ rong K. alvarezii Kí hiệu Vi khuẩn T1 Staphylococcus hominis T2 Pseudomonas aeruginosa T3 Clostridium perfringens T4 Acinetobacter baumannii T5 Vibrio parahaemolyticus T6 Vibrio harveyi
2.3.8. Bố trí thí nghiệm diệt sâu tơ
Giới(regnum): Animalia
Ngành(phylum): Arthropoda Lớp(class): Insecta
Bộ(ordo): Lepidoptera
Hình 2.5. Sâu tơ (P. xylostella)
Họ(familia): Plutellidae Chi(genus): Plutella
Loài(species): P. xylostella
Xác định ảnh hưởng của lectin lên sâu xanh hại rau ở các nồng độ khác nhau của dung dịch lectin sau quá trình tinh chế bằng sắc ký lọc gel ở các nồng độ: 0,1 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,4 mg/ml.
Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm diệt sâu tơ (P. xylostella) bằng dịch lectin từ rong K. alvarezii
Tiến hành phun trực tiếp dịch lectin từ rong lên lá cải rồi đặt chúng vào các hộp nhựa chứa 20 cá thể sâu mỗi hộp và các hộp được đặt trong khay chứa nước để ngăn
chặn các côn trùng hại mẫu thí nghiệm.
Tiến hành thay lá cho sâu ăn sau 24 giờ trong vòng 7 ngày và tiến hành quan sát ghi nhận kết quả sâu chết, qua đó đánh giá hiệu lực diệt sâu của lectin từ rong.
2.3.9. Bố trí thí nghiệm xua đuổi mọt gạo
Giới(regnum): Animalia
Ngành(phylum): Arthropoda
Lớp(class): Insecta
Bộ(ordo): Coleopteran Hình 2.7. Mọt gạo (S. oryzae)
Họ(familia): Curculionidae
Chi(genus): Sitophilus
Loài(species): S. oryzae
Xác định ảnh hưởng của lectin lên mọt gạo bằng dung dịch lectin sau sắc ký lộc gel ở nồng độ 0,4 mg/ml.
Thí nghiệm được bốtrí như trong hình 2.8:
Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm xua đuổi Mọt gạo bằng dịch lectin chiết từ rong K. alvarezii
Với lượng gạo chiếm khoảng 70% ở khay nhựa có chứa dịch lectin và 100% với khay nhựa chứa gạo trắng. Dịch lectin được thấm vào trong viên bông gòn thấm
nước với 200 ul dịch lectin và được đặt vào giữa khay có chứa khoảng 200 cá thể mọt
ở những độ tuổi khác nhau, sau 12 giờ lại tiếp tục bổ sung thêm 200 ul vào bông gòn. Kết quả được ghi nhận sau 12 giờ mỗi ngày và sau khi mọt có di chuyển hết khỏi khay chứa dịch lectin thì kết thúc thí nghiệm, ghi nhận kết quả.
2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường và vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft office Excel 2007.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH LECTIN TỪ RONG ĐỎ
KAPPAPHYCUS ALVERAZII
3.1.1. Chiết và tinh sạch lectin từ rong đỏ K.alverazii
Sau quá trình chiết lectin từ rong Sụn K. alvarezii bằng ethanol 20%, ly tâm thu dịch và bỏ cặn ở 6000 vòng/phút trong 15 phút. Tiếp tục kết tủa dịch chiết bằng ethanol 95%, theo tỷ lệ DC : ethanol (v/v) 1:4; ly tâm thu tủa ở 6000 vòng/phút trong
30 phút, lượng tủa thu được tiến hành xác định trọng lượng rồi tiến hành thẩm tách
qua đêm trong PBS 0,05M - pH 7, mục đích loại bỏ muối và các phân tử có khối lượng phân tử thấp không phải protein, làm tăng thêm độ tinh sạch cho chế phẩm lectin. Kết quả thống kê về hoạt tính ngưng kết (HA), hoạt độ riêng (HĐR), hoạt độ tổng số
(HĐTS), nồng độ ngưng kết nhỏ nhất (MAC) của quá trình tách chiết và tinh chế
lectin từ rong K.alveraziiđược trình bày trong bảng 3.1 dưới đây:
Bảng 3.1. Kết quả quá trình thu chiết lectin từ rong đỏ K. alvarezii
Mẫu V (ml) Protein (mg) HA (HU/ ml) MAC (mg/ HU) HĐTS (HU) HĐR (HU/ mg) Độ tinh sạch (lần) Dịch chiết 200 284 64 0,022 12800 45,07 1 Dịch sau thẩm tích 12,5 58,5 512 0,009 6400 109,4 2,43 Dịch lectin sau sắc ký lọc gel 7 9,52 512 0,003 3584 387,46 8,6
HĐR dịch lectin sau tinh sạch
Trong đó: Độ tinh sạch = (lần) HĐR dịch chiết thô
Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy, sau mỗi bước tách chiết, làm sạch dịch chiết lectin thì hoạt độ NKHC (HA) tăng lên đáng kể, điều này là do các phân tử không phải
Hoạt độ riêng (HĐR) của dịch lectin tăng từ 45,07 lên 109,4 (HU/mg) qua các
bước thu nhận. Độ tinh sạch của dịch cũng được tăng lên gấp 2,43 lần so với dịch thô
ban đầu. Nồng độ nhỏ nhất gây NKHC (MAC) của dịch lectin thu được giảm dần từ
0,022 mg/HU ở dịch thô và giảm xuống chỉ còn 0,009 mg/HU đối với dịch sau thẩm tách.
Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200
Lấy 1mL dịch tủa sau thẩm tách cho vào cột gel Sephacry S - 200, tiến hành chạy sắc ký lọc gel ở 40C với tốc độ 1,2mL/phút, dung dịch đẩy là đệm PBS 0,05M pH 7(đã được loại khí), thu 30 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn là 3 ml.
Tiến hành đo OD ở bước sóng 280 nm và xác định hoạt độ NKHC của từng
phân đoạn thu được. Vẽđồ thị biểu diễn sự tương quan giá trị OD280, hoạt độ NKHC và thứ tựcác phân đoạn.
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (A= 280nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacry S - 200
Từ hình 3.1 chúng tôi ghi nhận được 2 peak có chỉ sốOD cao, trong đó lượng protein mẫu chủ yếu tập trung vào peak số II. Như vậy, theo dự đoán sơ bộ, hỗn hợp protein qua lọc gel gồm 2 peak chủ yếu có 2 loại protein có khối lượng phân tử khác nhau.
Cũng dựa trên kết quả từ sắc ký đồ, mặc dù hàm lượng protein được thể hiện ở
2 peak, nhưng chỉ có peak số II mới thể hiện hoạt độ NKHC một cách rõ rệt nhất,
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 10 20 30 40 50 60 70 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Hoạt độ ngưng kết A 280 nm OD 280 Ho ạt tín h NKHC Phânđoạn II I
trong khi đó peak I lại không thể hiện hoạt độ NKHC. Từ đó, có thể dự đoán rằng protein lectin cần tinh sạch được phân bố chủ yếu tại peak số II này.
Trong peak số II, hoạt độ NKHC và hàm lượng protein tập trung chủ yếu ở các
phân đoạn 18, 19, 20, 21, 22 và 23 nên chúng tôi tiến hành thu hồi các phân đoạn này và ultrafilter (dùng màng lọc 10 kDa) dịch lectin sau sắc ký để cô đặc lại nồng độ và thể tích dịch để thực hiện quá trình chạy điện di xác định khối lượng phân tử lectin.
Kết quả từ bảng 3.1, qua các bước tinh sạch, chúng ta nhận thấy, HĐTS cũng như hàm lượng protein tổng số của chế phẩm thu được giảm đi đáng kể từ 12800 HU và 284 mg xuống còn 3584 HU và 9,52 mg tương ứng. Điều này có thể giải thích là do sự tổn thất và biến tính bất thuận nghịch của một số phân tử protein trong suốt quá trình tinh sạch.
Khi tiến hành tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel, lượng mẫu cho chạy qua cột sắc ký đã bị pha loãng nhiều lần trong pha động, đồng thời sự phân tách protein thành các peak dựa trên trọng lượng phân tử cũng đã loại bỏ được đáng kể
những protein không mong muốn nên dẫn hàm lượng protein lại giảm đáng kể.
Kết quả từ bảng 3.1 cũng cho thấy, qua các bước tinh sạch HĐR của protein lectin từ rong K. alvarezii tăng lên đáng kể (từ 45,07 HU/mg của DC, sau đó tăng lên
109,4 HU/mg ở dịch sau thẩm tách và đạt 387,46 HU/mg ở bước sắc ký lọc gel. Sự thay đổi này là vì quá trình tủa đã loại bớt được một số tạp chất và các protein không mong muốn cũng đã bị loại bỏ tiếp tục qua quá trình sắc ký lọc gel. Dựa trên nguyên tắc phân đoạn của sắc ký lọc gel với Sephacryl S – 200 cho phép thu được những phân tử protein có khối lượng phân tử nằm trong khoảng từ 5 đến 250 kDa và kết quả xác
định hoạt độ NKHC trên mỗi phân đoạn, chúng ta sẽ loại bỏ được các tạp chất và
protein có kích thước nằm ngoài giới hạn hoặc không thể hiện hoạt độ NKHC nên
HĐR của lectin sau khi tinh sạch và hệ số tinh sạch ở giai đoạn này đều cao nhất
(HĐR 387,46 HU/mg, độ tinh sạch là 8,6 lần). Kết quả này cũng được minh chứng rõ
hơn, khi nồng độ protein nhỏ nhất có thể tạo nên 1 đơn vị hoạt độ NKHC cũng giảm dần qua các bước tinh sạch: MAC ở dịch thô là 0,022 mg/HU; sau khi tủa giảm còn 0,009 mg/HU và sau khi sắc ký lọc gel giá trị này chỉ còn 0,003 mg/HU.
3.1.2. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử lectin bằng phương
Tiến hành chạy điện di các dịch protein thu được qua từng bước tinh sạch trên gel polyacrylamide nồng độ 12,5% với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V. Thang protein chuẩn là những protein có trọng lượng phân tử từ 6500 đến 116000 Da. Các
bước tiến hành chạy điện di được trình bày ở mục 2.3.5. Kết quảthu được như sau:
Hình 3.2. Kết quảđiện di protein lectin từ rong đỏ K. alvarezii qua từng bước tinh sạch
Trong đó:
Giếng 1: Thang chuẩn protein Giếng 2: DC thô
Giếng 3: Chế phẩm lectin sau thẩm tách
Giếng 4: Chế phẩm qua sắc ký lọc gel (peak II phân đoạn 18 đến 23) Giếng 5: Phân đoạn 20
Giếng 6: Phân đoạn 20 + chất khử 2-mercaptoethanol
Từ kết quả điện di trên gel và công thức tính trọng lượng phân tử của protein mục 3.1.1, có thểxác định được trọng lượng phân tửprotein lectin qua các bước tinh sạch.
Bảng 3.2. Trọng lượng phân tử lectin từ rong đỏ K. alvarezii qua các bước tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE
Giếng Mẫu Vạch 1 Vạch 2 Vạch 3
2 Dịch chiết thô - Chỉ lấy
band đậm 54819 (Da) 28318(Da) 18859(Da)
3 Chế phẩm lectin sau thẩm
tách 54819(Da) 28318(Da) 18859(Da)
4 Chế phẩm qua sắc ký lọc gel (peak II phân
đoạn 18 đến 23)
54819(Da) 28318(Da) _
5 Giếng 5 (phân đoạn 20) 28318(Da) _ _
6 Giếng 6 (phân đoạn 20 +
2-mercaptoethanol) 28318(Da)
_ _
Kết quả điện di từ hình 3.2 và bảng 3.2 cho thấy: sau mỗi bước tinh sạch, các protein tạp trong DC đã được loại bỏ đáng kể. So với giếng số 2, các vạch protein ở
giếng số 3 có màu đậm hơn và chỉ xuất hiện ở 3 vị trí (54,819; 28,318; 18,859 kDa),
trong đó vạch thứ 2 (ở vị trí 28,318 kDa) thể hiện rõ nhất. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả sắc ký đồ với nhựa Sephacryl S-200 khi ở đây xuất hiện lần lượt 2 peak,
trong đó peak thứ 2 có nồng độprotein cao hơn rất nhiều so với peak 1.
Ở giếng số 4, chỉ xuất hiện 2 vạch ở vị trí 54,819 và 28,318 kDa, trong đó vạch protein thứ 2 có khối lượng khoảng 28,318 kDa được nhận biết là của lectin, vì nó thể
hiện hoạt độ NKHC một cách rõ rệt nhất (hình 3.1). Trong khi đó, vạch ở vị trí 54,819 kDa lại rất mờ, đây có thể là do sự lẫn tạp protein từ peak số 1 sang trong quá trình phân tách protein của sắc ký lọc gel.
Giếng số 5 và số 6 lần lượt là kết quả điện di của phân đoạn 20 không có chất khửvà phân đoạn 20 có bổ sung chất khử 2-mercaptoethanol. Tuy nhiên, kết quả cho thấy, cả 2 giếng này đều chỉ xuất hiện một vạch duy nhất ở cùng một vị trí (28,318 kDa), do vậy có thể nói lectin của rong K. alvarezii đã được phân tách ra khỏi DC, có trọng lượng phân tử xấp xỉ 28,318 kDa và phân tử này tồn tại ở dạng đơn phân.
Kết quả thực nghiệm của chúng tôi cho thấy sựtương đồng cao đối với nghiên cứu của Rogers và cộng sựnăm 1991 [63] khi cho rằng, lectin từ rong biển thường có
trọng lượng phân tử thấp, khoảng từ 12 – 43kDa. Theo nghiên cứu của Kawakubo năm
1997 và 1999 [37, 38], lectin từ rong Eucheuma serra và E. amakusaensis cũng là những protein dạng monomer, có khối lượng phân tử xấp xỉ 29000Da. Ngoài ra, kết quả nghiên của của TS. Lê Đình Hùng và cộng sự năm 2011 về rong Kappaphycus alvarezii và E. denticulatum cũng cho thấy lectin của chúng có trọng lượng khoảng 28000 Da và tồn tại ở dạng monomer.
Mặt khác nghiên cứu của TS. Lê Đình Hùng và ctv cũng cho thấy, cũng giống
như lectin từ vi khuẩn hầu hết các lectin từ rong biển đều ở dạng monomer và có trọng
lượng phân tử thấp. Trong khi đó lectin từ thực vật bậc cao lại được tạo thành từ sự
gắn kết của 2 cho đến 4 monomer khác nhau và thường có trọng lượng phân tử lớn
hơn, dao động từ50000 đến 700000 Da [34].
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA LECTIN
3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ hoạt động tối ưu
Để khảo sát nhiệt độ tối ưu của lectin từ rong K. alvarezii, lectin sẽ được xử lý
ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 20oC đến 100oC trong vòng 30 phút, sau đó làm lạnh
nhanh và xác định hoạt độ NKHC của lectin với hồng cầu thỏđã xử lý trypsin. Kết quảđược trình bày trong bảng PL 5 và hình 3.3:
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NKHC của lectin từ rong K. alvarezii
Ở nhiệt độ 20oC HĐTS của lectin đạt giá trị cực đại HA = 29. Khi tăng dần nhiệt độ từ 20 đến 60oC thì hoạt độ của lectin vẫn không không thay đổi. Nhưng khi
0 100 200 300 400 500 600 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Hoạt độ NKHC HU/mL Nhiệt độ Hoạt độ NKHC HU/ml
nhiệt độ vượt quá 60oC thì hoạt độ NKHC bắt đầu giảm dần. Ở nhiệt độ 80oC, HĐTS
chỉ còn 64 HU và mất đi hoàn toàn khi nhiệt độtăng đến 90oC.
Nguyên nhân có thể do khi nhiệt độtăng cao đã làm đứt gãy một số liên kết yếu trong phân tửlectin, làm thay đổi cấu trúc của phân tử này, đặc biệt là cấu trúc trung tâm hoạt động của lectin, làm nó mất khả năng liên kết với các glycoprotein trên bề
mặt tế bào hồng cầu thỏ, từđó làm ảnh hưởng đến khảnăng ngưng kết của lectin. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của luận văn này cho thấy, cũng giống như một số
lectin từ rong biển khác, lectin từ rong K. alvarezii là một lectin khá bền nhiệt.