Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951)

M Ở ĐẦU

2.3.2. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951)

Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự năm

1951 , dùng Albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất chuẩn.

 Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở protein có khảnăng phản ứng với thuốc thử Folin tạo phức chất có màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng

độ protein trong một phạm vi nhất định. Đo cường độ màu bằng thiết bịđo màu quang điện ở bước sóng 750nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được

hàm lượng protein ở nồng độ vài chục micro gram (µg).

 Hóa chất

Dung dịch A: 4 g NaOH (0,1M) và 20 g Na2CO3 (2%) pha trong 1000 mL nước cất.

Dung dịch B: 0,5 g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%) hoặc trong dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1%.

Dung dịch C: Hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ49:1 (pha trước khi sử

dụng).

Thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng. Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1 mg/mL.

 Các bước tiến hành

Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10 mL nước cất, ta được dung dịch gốc có nồng

độ 1 mg/mL. Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µg/mL để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.

Lấy chính xác 0,5 mL dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào

ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 mL dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó,

thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 mL thuốc thửFolin đã pha loãng 2 lần, lắc

đều và để yên trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước sóng 750 nm.

Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy. Kết quảđược xử lý theo phương pháp thống kê thông thường.

Hình 2.1. Đường chuẩn protein theo phương pháp của Lowry

Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị và tiến hành bổ sung các hóa chất như đã

nêu trên. Sau đó, đem so màu ởbước sóng 750 nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để

tính giá trị protein. Làm thí nghiệm với mẫu kép và lấy giá trị trung bình.

y = 0.001x + 0.027 R² = 0.994 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 20 40 60 80 100 120 140 O D 750 Nồng độ protein (µg/mL)

2.3.3. Phương pháp tách chiết lectin từ rong K. alvarezii[10, 34] Rong Kappaphycus alvarezii Bảo quản -200C Thẩm tách làm sạch lectin Cắt, xay nhuyễn ở 40C Kết tủa lectin Chiết

Ly tâm thu kết tủa lectin

Lọc Loại bã

 Nhiệt độ chiết: 40C.  Dung môi: dung dịch

ethanol 20%.

 Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi(w/v) = 1:2

 Thời gian chiết: 8 giờ.

 Dung môi ethanol 95%.  Tỉ lệ nguyên liệu: dung

môi(v/v) = 1:4.  Nhiệt độ: 40C.  Thời qian: 4 giờ.

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình công nghệ thu nhận và tinh chế lectin từ rong K. alvarezii

Mẫu rong K. alvarezii thu từ biển Cam Ranh. Sau đó, rong được bảo quản trong các thùng xốp để tránh dập nát rồi đưa về phòng thí nghiệm. Tiến hành rửa sạch rong, cho vào các túi nilong, bảo quản trong tủ đông -20oC, xay rong thành bột mịn bằng cối xay inox có bổ sung Nitơ lỏng, chia đều rong thành các mẫu có khối lượng

như nhau để chuẩn bị cho quá trình tách chiết.

Dung môi dùng để chiết lectin là ethanol 20%, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) 1:2, thời gian chiết 8 giờ và nhiệt độ chiết 4oC. Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn lẫn trong DC, thu dịch trong để chuẩn bị cho quá trình tinh chế tiếp theo.

Sau đó, tiến hành kết tủa lectin bằng ethanol 95% với tỷ lệ DC : ethanol (v/v) là 1:4, nhiệt độ tủa 4oC và thời gian tủa 4 giờ. Tiến hành ly tâm lạnh dịch sau tủa ở 4oC với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút để thu phần kết tủa. Phần kết tủa được loại

Xác định:

 Ảnh hưởng của pH  Ảnh hưởng của nhiệt độ

 Khảnăng kháng khuẩn  Khảnăng diệt sâu xanh

hại rau

 Khảnăng xua đuổi mọt gạo Săc ký lọc gel S-200 Điện di SDS - PAGE Chế phẩm lectin thô Lectin

muối và các phân tử nhỏ không phải là lectin ra khỏi dung dịch chứa lectin bằng

phương pháp thẩm tách trong dung môi là PBS 0,05M, pH 7, 40C trong 8 giờ. Tiếp tục tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sepharyl S – 200. Xác định độ tinh sạch và trọng lượng phân tử của lectin qua các bước tinh sạch bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.

2.3.4. Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S- 200 [12, 24,

54]

 Nguyên tắc

Hình 2.3. Nguyên tắc của sắc ký lọc gel

Khi cho hỗn hợp chứa những phân tử có kích thước khác nhau qua cột sắc ký, chứa những lỗ có kích thước giới hạn nhất định thì các phân tửcó kích thước lớn hơn

không khuếch tán qua lỗ. Do đó, chúng sẽ ra khỏi cột trước. Những phân tử nhỏ

khuếch tán vào trong lỗ gel và di chuyển trong lỗ gel. Sau đó, chúng sẽ được đẩy ra khỏi cột bằng một dung dịch đẩy. Kết thúc quá trình sắc ký sẽthu được các protein có

kích thước khác nhau được phân tách.

Sephacryl S -200: là gel agarose, có khả năng phân tách những protein có kích

thước từ 5 × 103 - 2.5 × 105 Da. Vì vậy khi cho dung dịch chứa protein qua cột, những phân tử lớn sẽ ra khỏi cột trước, những phân tử có trọng lượng phân tử nhỏhơn sẽ đi

vào trong gel nên ra sau.

Các thông số tinh sạch bằng sắc ký lọc gel được thiết lập như sau:

- Kích thước cột: đường kính 1,6 cm, chiều cao 40 cm. - Đệm: PBS 0,05M pH 7 (đã loại khí)

- Thể tích mẫu qua cột: 1mL - Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút

- Thể tích mỗi phân đoạn thu nhận: 3mL/phân đoạn - Sốlượng phân đoạn: 30 phân đoạn

2.3.5. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương

pháp điện di SDS-PAGE [39]

 Nguyên tắc

Điện di là sự dịch chuyển các chất có điện tích trong điện trường, tốc độ dịch chuyển phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của chất đó.

SDS- PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein

được xử lý với SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol. Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cảcác protein đều được tích điện âm. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ còn phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích

thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta

thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tửkhác nhau đã biết.

 Đổ gel

 Gel phân tách 12,5% (Separating gel)

Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch:

Acrylamide/Bis (15,5:1) 3,8 mL Tris – HCl 3M; pH 8.8; 0,8 % SDS 5 mL Glycerine 2 g Nước cất 4,2 mL APS 10% 50 µL TEMED 5 µL

Sau khi cho TEMED vào, khuấy nhẹ, tiến hành đổ gel (tránh tạo bọt khí). Sau

đó nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp mặt gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 2 giờ).

 Stacking gel

Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch khác:

Acrylamide/Bis (15,5:1) 1 mL

Tris – HCl 3M; pH 6,8; 0,8 % SDS 3,1 mL

Nước cất 8,4 mL

APS 10% 100 µL

TEMED 10 µL

Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đỗ hết nước bên trên. Tiến hành đỗ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn.

Đồng thời đưa lược vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn

gel). Sau khi gel trùng ngưng, tháo lược, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung dịch điện di vào buồng điện di.

 Tiến hành chạy điện di

Cho 20µl dung dịch mẫu cần kiểm tra vào các giếng. Tiến hành chạy điện di

với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V. Quá trình điện di kết thúc dựa vào sự

dịch chuyển của vạch màu xanh (bromophenol) khi cách đáy gel khoảng 1 cm.

Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue R- 250, trong 30 phút. Sau đó cho tiến hành tẩy màu bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm (hỗn hợp methanol: acid acetic: nước). Protein sẽđược phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.

 Xác định trọng lượng phân tử của protein

Đo khoảng cách di chuyển của các băng protein từ gel phân tách tới các băng protein và khoảng cách từ gel phân tách tới vạch màu bromophenol (vạch màu cuối

cùng).

Tính giá trị Rf.

Rf = Khoảng cách di chuyển của protein lectin

Khoảng cách từgel phân tách đến dung môi (vạch màu Brommophenol)

Trọng lượng phân tử của các vạch protein có thể xác định thông qua giá trị Rf

trên, nhờphương pháp ngoại suy theo đồ thị.

Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của từng vạch protein. Kết quả được trình bày trong bảng PL 2. Từđó, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lgM (lg trọng lượng phân tử) của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel.

Hình 2.4. Đồ thịtương quan giữa lgM và Rf của protein trong thang chuẩn

Phương trình hồi quy tuyến tính thu được từ hình 2.4:

Y = -1,369x + 5,092

R2 = 0,985

Trong đó:

Y: là lgM (lg trọng lượng phân tử).

x: là Rf (tỷ số khoảng cách di chuyển của protein và vạch màu cuối cùng tính từ

gel phân tách).

Từ phương trình hồi quy tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lượng phân tử của protein theo công thức sau:

M = 10y

Trong đó:

M: là trọng lượng phân tử(đơn vị: Da)

y: là lgM

2.3.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các tác nhân: nhiệt độ, pH đến hoạt

tính NKHC của lectin từ rong K. alvarezii[34] a. Ảnh hưởng của nhiệt độ

y = -1.369x + 5.092 R² = 0.985 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Lg M Rf

Cho 0,5-1 ml mẫu dung dịch lectin đun nóng tại những nhiệt độ khác nhau: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100(0C) trong 30 phút, sau đó làm lạnh ngay trong đá và đo

lại hoạt tính NKHC đểxác định ảnh hưởng của nhiệt độđế hoạt tính NKHC của lectin từ rong K. alvarezii.

b. Ảnh hưởng của pH

Cho 0,5 đến 1 ml mẫu dung dịch lectin thẩm tách với dung dịch đệm ở nhiệt độ

phòng, qua đêm với các mức pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Sau đó, thẩm tách

ngược lại với NaCl 0,85%.

Phần dịch trong túi thẩm tách được thu lại và thử hoạt tính NKHC để xác định

ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong K. alvarezii.

Những dung dịch đệm được sử dụng:

Đệm acetate pH: 3, 4, 5 Acitic acid/ acetate natri

Đệm phosphate pH: 6, 7 Na2HPO4.12H2O/ NaH2PO4.2H2O

Đệm tris HCl pH: 8 Tris/HCl

Đệm cacbonate pH: 9, 10 Na2CO3/NaHCO3

2.3.7. Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn của lectin từ rong K.

alvarezii

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của lectin từ rong K. alvarezii bằng phương

pháp khuếch tán trên giếng thạch.

 Tiến hành

- Chuẩn bị dịch huyền phù của vi khuẩn đã được nuôi cấy qua 24 giờ với mật độ

khoảng 109 tế bào/mL. Trải dịch huyền phù vi khuẩn lên môi trường thạch trong đĩa

petri.

- Sử dụng thanh kim loại vô trùng để tạo thành những giếng nhỏ có đường kính khoảng 5mm trên bề mặt môi trường thạch.

- Nhỏ một lượng lectin nhất định vào mỗi giếng của đĩa thạch. Hoạt chất lectin sẽ

khuếch tán trên môi trường thạch, ức chế sựsinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, tạo vòng vô khuẩn.

- Ủ đĩa ở 370C. Sau 24 giờ, kiểm tra sự tạo thành vòng vô khuẩn, đo đường kính vòng vô khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tùy thuộc vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ.

 Vi khuẩn thí nghiệm

Bảng 2.1. Các vi khuẩn dùng trong thí nghiệm khảo sát hoạt độ kháng khuẩn của lectin từ rong K. alvarezii Kí hiệu Vi khuẩn T1 Staphylococcus hominis T2 Pseudomonas aeruginosa T3 Clostridium perfringens T4 Acinetobacter baumannii T5 Vibrio parahaemolyticus T6 Vibrio harveyi

2.3.8. Bố trí thí nghiệm diệt sâu tơ

Giới(regnum): Animalia

Ngành(phylum): Arthropoda Lớp(class): Insecta

Bộ(ordo): Lepidoptera

Hình 2.5. Sâu tơ (P. xylostella)

Họ(familia): Plutellidae Chi(genus): Plutella

Loài(species): P. xylostella

Xác định ảnh hưởng của lectin lên sâu xanh hại rau ở các nồng độ khác nhau của dung dịch lectin sau quá trình tinh chế bằng sắc ký lọc gel ở các nồng độ: 0,1 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,4 mg/ml.

Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm diệt sâu tơ (P. xylostella) bằng dịch lectin từ rong K. alvarezii

Tiến hành phun trực tiếp dịch lectin từ rong lên lá cải rồi đặt chúng vào các hộp nhựa chứa 20 cá thể sâu mỗi hộp và các hộp được đặt trong khay chứa nước để ngăn

chặn các côn trùng hại mẫu thí nghiệm.

Tiến hành thay lá cho sâu ăn sau 24 giờ trong vòng 7 ngày và tiến hành quan sát ghi nhận kết quả sâu chết, qua đó đánh giá hiệu lực diệt sâu của lectin từ rong.

2.3.9. Bố trí thí nghiệm xua đuổi mọt gạo

Giới(regnum): Animalia

Ngành(phylum): Arthropoda

Lớp(class): Insecta

Bộ(ordo): Coleopteran Hình 2.7. Mọt gạo (S. oryzae)

Họ(familia): Curculionidae

Chi(genus): Sitophilus

Loài(species): S. oryzae

Xác định ảnh hưởng của lectin lên mọt gạo bằng dung dịch lectin sau sắc ký lộc gel ở nồng độ 0,4 mg/ml.

Thí nghiệm được bốtrí như trong hình 2.8:

Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm xua đuổi Mọt gạo bằng dịch lectin chiết từ rong K. alvarezii

Với lượng gạo chiếm khoảng 70% ở khay nhựa có chứa dịch lectin và 100% với khay nhựa chứa gạo trắng. Dịch lectin được thấm vào trong viên bông gòn thấm

nước với 200 ul dịch lectin và được đặt vào giữa khay có chứa khoảng 200 cá thể mọt

ở những độ tuổi khác nhau, sau 12 giờ lại tiếp tục bổ sung thêm 200 ul vào bông gòn. Kết quả được ghi nhận sau 12 giờ mỗi ngày và sau khi mọt có di chuyển hết khỏi khay chứa dịch lectin thì kết thúc thí nghiệm, ghi nhận kết quả.

2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường và vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft office Excel 2007.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH LECTIN TỪ RONG ĐỎ

KAPPAPHYCUS ALVERAZII

3.1.1. Chiết và tinh sạch lectin từ rong đỏ K.alverazii

Sau quá trình chiết lectin từ rong Sụn K. alvarezii bằng ethanol 20%, ly tâm thu dịch và bỏ cặn ở 6000 vòng/phút trong 15 phút. Tiếp tục kết tủa dịch chiết bằng ethanol 95%, theo tỷ lệ DC : ethanol (v/v) 1:4; ly tâm thu tủa ở 6000 vòng/phút trong

30 phút, lượng tủa thu được tiến hành xác định trọng lượng rồi tiến hành thẩm tách

qua đêm trong PBS 0,05M - pH 7, mục đích loại bỏ muối và các phân tử có khối lượng phân tử thấp không phải protein, làm tăng thêm độ tinh sạch cho chế phẩm lectin. Kết quả thống kê về hoạt tính ngưng kết (HA), hoạt độ riêng (HĐR), hoạt độ tổng số

(HĐTS), nồng độ ngưng kết nhỏ nhất (MAC) của quá trình tách chiết và tinh chế

lectin từ rong K.alveraziiđược trình bày trong bảng 3.1 dưới đây:

Bảng 3.1. Kết quả quá trình thu chiết lectin từ rong đỏ K. alvarezii

Mẫu V (ml) Protein (mg) HA (HU/ ml) MAC (mg/ HU) HĐTS (HU) HĐR (HU/ mg) Độ tinh sạch (lần) Dịch chiết 200 284 64 0,022 12800 45,07 1 Dịch sau thẩm tích 12,5 58,5 512 0,009 6400 109,4 2,43 Dịch lectin sau sắc ký lọc gel 7 9,52 512 0,003 3584 387,46 8,6

HĐR dịch lectin sau tinh sạch