M Ở ĐẦU
1.5.2. Các kỹ thuật tinh chế lectin
Sắc ký lọc gel
Đây là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thước phân tử. Chất giá thường được sử dụng là Sephadex. Mỗi hạt Sephadex có bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗlưới xốp. Có nhiều loại
Sephadex, trong đó mỗi loại có mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thước của lỗ
kích thước phân tửkhác nhau. Để tinh chết lectin, người ta thường dùng loại Sephadex G-75 và Sephadex G-100.
Phương pháp sắc ký lọc gel còn được dùng để xác định khối lượng phân tử của chất cần tách.
Sắc ký trao đổi ion
Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích. Tùy thuộc vào pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm. Lợi dụng tính chất này
người ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin. Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dương như DEAE-sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE-
trisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi anion. Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi cation. Mỗi chất trao đổi ion đều có khảnăng trao đổi một lượng ion nhất
định gọi là dung lượng trao đổi. Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hóa và khảnăng trao đổi ion của phân tử
lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định.
Sắc ký ái lực
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là chất kết hợp (ligand) được gắn vào một chất giá tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký. Chất giá được sử dụng nhiều nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel….Quá trình thực hiện sắc ký ái lực được tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột ái lực với lectin, giai đoạn 2 là gắn hay hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực. - Giai đoạn 1: Thiết kế cột ái lực lectin: việc lựa chọn chất kết hợp có ái lực đặc hiệu với protein cần tách có ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, cần phải dựa vào tính chất của protein cần tách, đặc tính lý hóa của chất kết hợp và đặc biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa protein và chất kết hợp. Trong các thí nghiệm tinh chếlectin người ta thường lựa chọn các chất đường, glycoprotein hoặc chất cộng hợp đường có ái lực hóa học với một lectin nhất định.
- Giai đoạn 2: Hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất không có ái lực với cột: Các protein có ái lực với cột cần được tạo điều kiện tốt cho quá trình hấp phụ (pH, nhiệt
độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ởgiai đoạn này các protein không có ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột.
- Giai đoạn 3: Giải hay phản hấp phụ lectin ra khỏi cột: Cần phải dùng một dung dịch giải hấp phụ có ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi cột.
Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU