Locus Ty-1 đã được lập bản đồđầu tiên trên nhiễm sắc thể số 6 với các Chỉ
thị RFLP TG297 và TG97 sử dụng các quần thểđược tao ra từ từ hợp lai giữa dòng mẹ mẫn cảm cảm M82-1-8 (S. lycopersicum) với mẫu giống kháng LA1969 thuộc loài dại S. chilense (Zamir et al., 1994). Các cây mang alen đồng hợp tử từ LA1969 nằm trong vùng giữa các chỉ thị RFLP TG297 và TG97 thể hiện tính kháng cao, không có triệu chứng bệnh khi lây nhiễm với TYLCV. Các chỉ thị dựa trên RFLP TG97 liên kết chặt với gen Ty-1 đã được phát triển tại Hebrew University of Jerusalem, Israel. Chỉ thị CAPS JB-1 liên kết chặt với Ty-1đã được xác định, nó cho phép chọn lọc nhanh gen Ty-1 bằng phản ứng PCR với một cặp mồi đặc hiệu (Castro et al., 2007). Marker JB-1 có nguồn gốc từ RFLP C21, nó tạo ra 3 alen khác nhau nhờ cắt hạn chế sản phẩm PCR bằng enzyme TaqI. Alen 1 có kích thước gần 400bp,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
alen 2 hơi lớn hơn 400 bp và alen 3 có kích thước 500bp. Alen 2 và 3 là đồng trội và trội hơn alen 1. Các giống xuất hiện alen 3 là giống có gen Ty-1, các giống có alen 1 là alen mẫn cảm ty-1, alen 2 có nguồn gốc từ một loài cà chua dại khác. Mới đây, Cuixuan et al. (2012)đã phát triển thành công chỉ thị TG97, cho phép phát hiện và phân biệt kiểu gen kháng Ty1 cả dạng đồng và dị hợp tử. Theo đó, sản phẩm PCR tạo bởi cặp mồi TG97F/R có kích thước 398 bp, sau khi cắt bằng TaqI, các giống có kiểu gen kháng
Ty-1 đồng hợp cho 2 vạch là 303 và 95 bp; kiểu gen Ty-1 dị hợp tử cho 3 vạch 398, 303 và 95 bp; các giống không mang alen kháng thì không bị cắt (398 bp).
Locus Ty-2 đã được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 11 với các Chỉ thị
RFLP TG393 và TG36 sử dụng nguồn kháng là dòng giống H24 có nguồn gốc từ
S. habrochaites (Hanson et al., 2000). Hiện nay, một số chỉ thị dựa trên PCR cho vùng DNA chuyển vị từS. habrochaitesđã được phát triển. Chỉ thị CAPS TG105A cho thấy khả năng khuếch đại mạnh và cắt hạn chế sản phẩm PCR bằng enzyme
TaqIđã tạo ra các đoạn DNA đa hình cho S. habrochaites và S. lycopersicum. Một marker dựa trên PCR khác là T0302 cũng được phát triển cho locus Ty-2 mà không phải dùng enzyme giới hạn. Phân tích liên kết cho thấy TG105A và T0302 liên kết chặt với nhau, khoảng cách của các marker này với gen Ty-2 là xấp xỉ 10 cM (Ji et al., 2007c). Các nghiên cứu chọn tạo giống sử dụng chỉ thị phân tửđể chọn lọc gen kháng Ty-2 gần đây đều chấp nhận sử dụng chỉ thị T0302 như là chỉ thị tốt nhất đối với gen kháng này.
Năm 2006, Agrama và Scott đã đưa ra một bản đồ QLT cho tính kháng TYLCV và ToMoV (Tomato Mottle Virus) trong các accession S. chilense
LA2779 và LA1932 sử dụng các chỉ thị RAPD (Ji và cộng sự, 2007a; Pena và cộng sự, 2010). Nghiên cứu này cho thấy có 3 vùng trên nhiễm sắc thể số 6 góp phần tạo nên tính kháng cả hai virus TYLCV và ToMoV. Vùng thứ nhất chính là vùng có chứa gen khánh Ty-1, trong khi hai vùng khác nằm hai bên sườn của locus sp (self- pruning) và c (potato leaf). Các Chỉ thị RAPD liên kết với tính kháng trong các vùng này đã được xác định bằng cách sử dụng các dòng giống kháng có nguồn gốc từ các accession LA2779 và LA1932. Sau đó, Ji và cộng sự (2007b) đã lập một bản
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 đồ chi tiết cho tính kháng begomovirus và nhận ra một vùng DNA lớn được chuyển vị từS. chilense kéo dài từ marker C2_A2g39690 đến T0834 trong các dòng giống có nguồn gốc từ LA2779 kháng cả hai virus TYLCV và ToMoV. Một locus kháng
begomovirusđã được lập bản đồở khoảng giữa marker cLEG-31-P16 và 1079 trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 6, và được xác định là Ty-3. Phía trên locus Ty-3, vùng DNA lớn được chuyển vào này cũng nối với vùng Ty-1 gần gen Mi, gợi ý rằng các alen tại cả hai locus Ty-1 và Ty-3 có khả năng cùng tồn tại và nối với nhau. Trái lại, các dòng giống tiên tiến có nguồn gốc từ LA1932 có một vùng DNA
được chuyển vào ngắn hơn, từ cLEG-31-P16 đến C2_A5g41480, vùng này cũng mang một locus kháng begomovirus có lẽ là một alen thuộc locus Ty-3. Ji và Scott (2006) đã xác định rằng các locus Ty-3 định vị trong một khu vực bao gồm locus FER (25 cM, BAC clone 56B23, AY678298). Kết quả giải trình tự gen G8 của BAC clone 56B23 cho thấy trình tự tại đây là khác nhau đối với các dòng có nguồn gốc từ S. chilense LA2779 và LA1932 (Maxwell et al., 2007). Để phân biệt hai vùng chuyển vị này, vùng LA2779 được chỉ định là Ty-3 và vùng từ LA1932 được chỉđịnh là Ty-3a. Chỉ thịđồng trội FLUW25 (SCAR marker) đã được phát triển (Ji et al., 2007c) cho phép phát hiện được kháng Ty-3 và mẫn cảm ty-3 (S. lycopersicum), nhưng không phát hiện được alen Ty-3a (Ji et al., 2007a). Để khắc phục vấn đề này, nhóm tác giả trên đã phát triển chỉ thịđồng trội SCAR đặt tên là P6-25 cho phép phát hiện được các alen Ty-3, ty-3 và Ty-3a (Ji et al., 2007a). Khi sử dụng cặp mồi P6-25F2/R5 này để sàng lọc một vài giống lai thương mại từ các công ty, các tác giảđã thu được đoạn DNA PCR kích thước 660 bp từ 3 giống lai thương mại, các doạn DNA này được giải trình tự và cho thấy 100% tương đồng với đoạn từS. chilense LA1969. Vùng chuyển vị mới được phát hiện có nguồn gốc từ S.chilense LA1969 này được gọi là Ty-3b (Ji et al., 2007a).
Ji et al. (2008) đã phát hiện một vùng chuyển vị S. chilense 14 cM trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 3 trong một số dòng giống kháng có nguồn gốc từ
LA1932. Sau đó, một locus kháng begomovirus mới là Ty-4 đã được lập bản đồ
bằng các chỉ thị vào khoảng 2,3 cM giữa C2_A4g17300và C2_A5g60160 trong vùng chuyển vị (Ji et al., 2009). Phân tích quần thể phân ly về locus Ty-3 và Ty-4
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 đã chứng minh rằng Ty-3 giải thích 59,6% biến dị kiểu hình kháng (phenotypic variation), trong khi Ty-4 chỉ giải thích cho 15,7%, điều này gợi ý rằng Ty-4 tạo ra một hiệu lực kháng TYLCV nhỏ hơn. Các dòng tái tổ hợp mang cảTy-3 và Ty-4 có mức kháng cao hơn với TYLCV (Ji et al., 2009).
Hình 1.1. Bản đồ gen Ty-3 trên nhiễm
sắc thể số 6 (Ji et al., 2007b) Hình 1.2. Bản đồ phân tử gen Ty-4
trên nhiễm sắc thể số 3 (Ji et al., 2009) Anbinder et al. (2009) đã lập bản đồ một QLT lớn và bốn QLT phụ nhỏ góp phần tạo nên tính kháng TYLCV trong dòng giống TY172 có nguồn gốc từ S. peruvianum. QLT lớn được đặt tên là Ty-5, được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 4 trong vùng lân cận của marker SINAC1 và chịu trách nhiệm 39.7 - 46.6% biến dị kiểu hình. Các QLT nhỏ, bắt nguồn từ các dòng bố mẹ kháng hoặc mẫn cảm, được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số
1, 7, 9 và 11, và chịu trách nhiệm 12% biến dị về mức độ nghiêm trọng theo triệu chứng, bổ sung tính kháng cho gen Ty-5 (Anbinder et al., 2009b).
Đã có nhiều cố gắng trong việc nhận diện và lập bản đồ các gen qui định tính kháng TYLCV trong S. pimpinellifolium và S. cheesmaniae nhưng không tạo ra được các bản đồ tốt cũng như không tìm ra được các marker liên kết chặt phù hợp cho MAS (Pena et al., 2010).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
- 21 tổ hợp cà chua lai F1 chín chậm, kháng virus xoăn vàng lá và mốc sương được cung cấp bới trung tâm bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồng (bảng 3.1).