- Thí nghiệm 1: Đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng, tính chín chậm, khả năng kháng xoăn vàng lá và mốc sương của các THL F1.
3.2.4.PCR xác định các cá thể có gen kháng xoăn vàng lá Ty-2 và Ty-
20 H13.162.7/1315 Thơm Chua dịu Trung bình mềm mịn Khô nhẹ 0,8 4,
3.2.4.PCR xác định các cá thể có gen kháng xoăn vàng lá Ty-2 và Ty-
Một số nghiên cứu đã cho thấy khả năng kháng cao hơn khi kết hợp các gen
Ty-1, Ty-2 với gen kháng Ty-3. Sử dụng kết hợp nhiều gen kháng còn cho phép cây kháng tốt hơn, kháng được nhiều chủng loài virus hơn và tính kháng bền vững hơn với các tác nhân gây bệnh. Chính vì thế, việc quy tụ thêm các gen kháng xoăn vàng lá khác nhau là rất cần thiết để có được giống kháng tốt hơn. Vì thế trong thí nghiệm này, từ 21 cá thể có các gen Ph-3, Ty-3 và rinđã xác định ở các thí nghiệm trước, chúng tôi tiếp tục sử dụng chỉ thị phân tử để xác định các cá thể có gen Ty-2 và Ty-1 nhằm tạo ra các dòng có nhiều gen kháng virus xoăn vàng lá để có được tính kháng tốt tương tự như dòng bố 1219.
Hanson et al. (2006) đã xác định gen Ty-2 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể
11, nằm giữa chỉ thị TG36 và TG26. Garcia et al. (2007) đã phát triển chỉ thị đồng trội SCAR T0302 liên kết chặt với gen Ty-2, sử dụng cặp mồi T0302F/TY2R1, cho phép phát hiện được kiểu gen kháng đồng và dị hợp tử. Sản phẩm PCR có một đoạn DNA dài 600 bp tương ứng với alen kháng Ty-2 đồng hợp tử, đoạn 450 bp tương
ứng alen mẫn cảm ty-2, kiểu gen dị hợp tử Ty-2/ty-2 xuất hiện 3 đoạn DNA 450, 600 và 700 bp. Dựa vào kết quả phân tích các sản phẩm PCR với cặp mồi
T0302F/TY2R1 trên 21 cá thể nghiên cứu, chúng tôi đã xác định được 6 cá thể có kiểu gen kháng Ty-2đồng hợp tử, 10 cá thể dị hợp tử và 5 cá thể không có gen Ty-2
(hình 3.6; bảng 3.12).
Ty-1 là gen trội được sử dụng sớm nhất để tạo ra các giống kháng xoăn vàng lá trên thế giới (Ji et al., 2007b). Han et al. (2012) đã phát triển thành công chỉ thị đồng trội CAPS TG97 cho phép phân biệt được kiểu gen kháng đồng và dị hợp tử
Ty-1. Sản phẩm PCR với cặp mồi TG97F/R là một đoạn DNA dài 398 bp ở tất cả
các mẫu giống. Sau khi cắt sản phẩm bằng enzyme TaqI, các mẫu giống mang gen
Ty-1đồng hợp tử xuất hiện 2 vạch băng dài 303 bp và 95 bp, các mẫu giống mang gen Ty1 dị hợp tử xuất hiện 3 vạch băng dài 398, 303 và 95 bp, các mẫu giống không có gen kháng không bị cắt nên chỉ có một vạch dài 398 bp (Han et al., 2012).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61
Kết quả PCR và cắt sản phẩm với TaqI của chúng tôi đã cho các vạch băng 303 và 398 bp đều hiển thị rõ nét trên bản gel agarose 1,5%, tuy nhiên vạch băng 95 bp hiển thị rất mờ, nhiều mẫu không quan sát thấy vạch băng này. Nguyên nhân có thể
là do vạch băng 95 bp ngắn nên hàm lượng DNA ở vạch băng này ít hơn đáng kể so với các băng 303 và 398 bp, do đó khả năng phát quang kém hơn. Tuy vậy, chỉ cần căn cứ sự có mặt của vạch 303 và 398 là có thể xác định được các kiểu gen kháng: nếu chỉ có vạch 303 bp thì là kiểu gen kháng đồng hợp tửTy1/Ty1, nếu chỉ có vạch 398 bp là kiểu gen ty1/ty1, nếu có vạch 398 và 303 là kiểu gen Ty1/ty1. Dựa vào kết quả phân tích các sản phẩm PCR sau khi cắt bằng TaqI đối với 21 cá thể đã chọn, chúng tôi đã xác định được 7 cá thể có kiểu gen kháng đồng hợp tửTy-1/Ty- 1; 8 cá thể có kiểu gen kháng dị hợp tử và 6 cá thể không có gen Ty-1 (bảng 3.13 và hình 3.7).
Hình 3.6. Ảnh điện di một số cá thể bằng chỉ thị T0302 phát hiện gen Ty-2
L: 100 -1000 DNA Ladder; cá thể 21, 37, 44: kiểu gen Ty-2/Ty-2; cá thể 3, 7, 31, 39: kiểu gen Ty-2/ty-2; các cá thể khác: không có Ty-2
Bảng 3.12. Các cá thể mang gen Ty-2 chọn được bằng cặp mồi T0302 F/Ty2R1
Quần thể Ty-2/Ty-2 Ty-2/ty-2 331/1219 21, 37, 44, 49, 109, 130 3, 7, 31, 39, 48, 77, 81, 103, 118, 151 L 3 7 21 25 31 37 39 44 46 700bp 600bp 450bp
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62
Hình 3.7. Ảnh điện di một số cá thể bảng chỉ thịTG97 phát hiện gen Ty1
L: 250 – 10000 bp DNA ladder; cá thể 3, 31, 39, 46, 66, 86, 151: kiểu gen Ty1/Ty1; cá thể 7, 25, 44, 49, 81, 93, 103, 130: kiểu gen Ty-1/ty-1; các cá thể khác:không có
gen Ty-1
Bảng 3.13. Các cá thể mang gen Ty-1 chọn được bằng cặp mồi TG97F/R
Quần thể Ty-1/Ty-1 Ty-1/ty-1
331/1219 3, 31, 39, 46, 66, 86, 151 7, 25, 44, 49, 81, 93, 103, 130