a.Tạo dòng bất dục di truyền nhân cảm ứng môi trường (EGMS)
Theo Virmani(2003) có 6 phương pháp sau phương pháp tạo dòng EGMS: Đánh giá tập đoàn các dòng giống hiện có, gây đột biến, lai và chọn lọc pedigree, nuôi cấy bao phấn và lai trở lại chọn lọc nhờ maker (MAS). Trong đó nhập nội là phương pháp nhanh nhất phù hợp với những nơi chọn tạo giống lúa lai còn gặp nhiều khó khăn về kinh tế và điều kiện nghiên cứu.
Nhập nội các dòng EGMS sẵn có từ các đơn vị nghiên cứu như Viện lúa Quốc tế IRRI, các Viện nghiên cứu lúa lai và các Trường Đại học nghiên cứu nông nghiệp Trung Quốc là đón đầu những thành tựu khoa học mới của
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 thế giới. Tuy nhiên mỗi dòng có khả năng thích nghi với điều kiện sinh thái từng vùng nên sau khi nhập cần phải đánh giá chọn lọc lại. Trên cơ sở đó tuyển chọn những dòng ưu tú phù hợp với điều kiện sinh thái (Nguyễn Công Tạn, 2002).
Hệ thống bất dục đực di truyền nhân mẫn cảm với môi trường được điều khiển bởi gen nhân chịu ảnh hưởng của môi trường như: nhiệt độ, quang chu kỳ hoặc cả hai yếu tố trên. Hiện tượng bất dục mẫn cảm với môi trường được Martin và Crawford phát hiện đầu tiên trên cây tiêu (Pepper) năm 1951 và sau đó phát hiện thêm trên một số cây trồng khác (Virmani, 2003).
* Phân loại các dòng EGMS
Tùy thuộc các nhân tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng bất dục mà dòng EGMS được phân các loại sau:
- TGMS: Bất dục đực nhân mẫn cảm với nhiệt độ
-rTGMS: Bất dục đực nhân mẫn cảm với nhiệt độ nghịch: khi gặp nhiệt độ thấp thì bất dục đực (<24oC ban ngày >16oC ban đêm)khi gặp nhiệt độ cao thì hữu dục (>30oC ban ngày/24oC ban đêm). Ví dụ các dòng: JP 38, Dianxin 1A và IV A (Virmani, 2003).
- PGMS: Bất dục đực nhân mẫn cảm với quang chu kỳ
- rPTGMS: Bất dục đực nhân mẫn cảm với quang chu kỳ nghịch - PTGMS: Bất dục đực nhân mẫn cảm với quang chu kỳ và nhiệt độ Nguồn EGMS có giá trị thực tế trong chọn tạo lúa lai hai dòng là kiểu bất dục đực cảm ứng với quang chu kỳ (Photoperiodic- sensitive Genic Male Sterility -PGMS) và bất dục đực cảm ứng nhiệt độ (Thermo-sensitive Genic Male Sterility -TGMS).
* Dòng bất dục đực di truyền nhân cảm ứng với điều kiện nhiệt độ (Thermo sensitive Genic Male Sterile - TGMS):
Dòng TGMS là dòng mẫn cảm với nhiệt độ gây nên bất dục và hữu dục hạt phấn. Hầu hết các dòng TGMS đều bất dục ở nhiệt độ cao (nhiệt
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 độ ban ngày >30oC/ nhiệt độ ban đêm > 24oC) và hầu hết các TGMS hữu dục ở nhiệt độ thấp (nhiệt độ ban ngày <24oC/ nhiệt độ ban đêm > 16oC), ví dụ như:5460S, IR68945, H89-1 và SA2 (Virmani, 2003). Giai đoạn cảm ứng với nhiệt độ của các dòng TGMS khác nhau, do nguồn gen và cơ sở di truyền của từng dòng quyết định (Borkakati, 1997). Nhiều nghiên cứu cho thấy giai đoạn cảm ứng của dòng TGMS từ giai đoạn 16 ngày đến 13 ngày trước trỗ. Giai đoạn phân chia tế bào mẹ hạt phấn (khoảng 11-8 ngày trước trỗ) là giai đoạn mẫn cảm nhất với nhiệt độ.
Dòng TGMS nói chung bất dục đực khi gặp nhiệt độ trung bình ngày cao và hữu dục khi gặp nhiệt độ trung bình ngày thấp vào thời kỳ lúa phân hóa đòng từ cuối bước 3 đến bước 6 (Nguyễn Công Tạn, 2002; Yuan L.P. and Xi.Q.F., 1995), thời kỳ này được gọi là thời kỳ cảm ứng. Gen kiểm soát tính cảm ứng với sự thay đổi của điều kiện nhiệt độ là một cặp gen lặn, ký hiệu là tms.
Quá trình hoạt động của gen tms luôn có liên kết với một số gen khác, ví dụ như khi nhiệt độ cao gen tms biểu hiện chức năng gây bất dục mạnh đồng thời liên kết hoạt động với gen khống chế chiều dài lóng cuối cùng. Vì vậy trong điều kiện bất dục dòng TGMS trỗ nghẹn đòng như các dòng CMS. Trái lại trong điều kiện hữu dục cũng dòng TGMS đó nhưng trỗ thoát hoàn toàn nghĩa là mối liên kết với gen khống chế chiều dài lóng cuối cũng hoạt động theo hướng khác (Nguyễn Thị Trâm, 2000).
Thời kỳ cảm ứng nhiệt độ của dòng TGMS tương đối ngắn và muộn. Nhiệt độ tới hạn gây bất dục và hữu dục của các dòng rất khác nhau.
Theo Nguyễn Thị Trâm (1998) cho biết: kiểu bất dục đực chức năng di truyền nhân đặc trưng cho loài phụIndica là Annong S-1 có giới hạn chuyển hóa hữu dục- bất dục ở nhiệt độ từ 23-26oC.
Theo Nguyễn Văn Hoan (1999) thì ở miền Bắc Việt Nam có 2 giai đoạn mà nhiệt độ môi trường phù hợp với việc nhân dòng TGMS là từ 10-30/3 và 15-25/10. Đây là giai đoạn có thể cho năng suất hạt tự thụ cao. Vậy chúng ta
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 có thể bố trí nhân duy trì dòng TGMS trong vụ chiêm xuân sao cho lúa trỗ trước 15/4.
Dạng bất dục TGMS do yếu tố nhiệt độ tác động ở nhiệt độ cao bất dục, nhưng ở nhiệt độ thấp hữu dục bình thường (Chen, 2010; Hai Zhou, 2012). Di truyền TGMS do cặp gen lặn tms trong nhân kiểm soát (Peng, 2010; Zhang, 2013).
Jiang et al (2015) chọn tạo dòng TGMS kháng đạo ôn bằng việc lai giữa dòng VE6219 (thể cho) có gen kháng đạo ôn Pi2 với dòng C815S, sau đó sử dụng chỉ thị phân tửđể chọn từ thế hệ BC1F1. Dòng C815S kháng đạo ôn có ngưỡng nhiệt độ chuyển đổi tính dục trong khoảng 22-230C.
Các nhà khoa học cũng xác định có các gen ký hiệu là tms1, tms2, tms3, tms4(t), tms5, tms6, tmsX, (Yubin Xu, 2010) kiểm soát tính trạng bất dục đực cảm ứng với nhiệt độ. Gen tms1 phát sinh nhờ đột biến tự nhiên, do Sun và Yang và cộng sự phát hiện ở giống lúa IR54, nằm trên nhiễm sắc thể thứ 8. Gen tms2 do Maruyama (Lu, 1994) tạo ra bằng phương pháp gây đột biến bằng tia Gamma ở giống lúa Reimei, nằm trên nhiễm sắc thể số 7(Janick,1999). Theo Lê Duy Thành (2001) gen tms3 do Virmani và Subudhi (1995) tạo ra bằng phương pháp gây đột biến bằng tia gamma ở giống lúa IR32364 nằm trên nhiễm sắc thể số 6. Ở Việt Nam, Nguyễn Văn Đồng đã sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử (phương pháp phân tích BSA kết hợp với kỹ thuật AFLP và RFLP) để định vị gen tms4(t) từ dòng TGMSVN1, gen này nằm cạnh tâm động trên vai ngắn của nhiễm sắc thể số 4. Wang (1995) sử dụng phương pháp phân ly theo nhóm ở thế hệ F2 của tổ hợp 5460S/Hồng vân 52 để xác định chỉ thị RAPD liên kết với gen tms1. Yamaguchi (1997) đã phát hiện ra sự liên kết của chỉ thị phân tử với gen tms2. Các tác giả nghiên cứu locus tms2 bằng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử (RFLP) ở một quần thể F2 của tổ hợp lai Norin PL12 và giống Dular. Kết quả cho thấy
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 gen tms2 ở vị trí giữa chỉ thị R643 và R1440 trên nhiễm sắc thể thứ 7. Sử dụng kỹ thuật SSR đã xác định chỉ thị phân tử RM11 liên kết chặt với gen
tms2 định vị trên nhiễm sắc thể số 7. Gen tms2 được IRRI sử dụng tạo nhiều dòng TGMS mới phục vụ phát triển lúa lai cho vùng nhiệt đới (Hoàng Tuyết Minh, 2002).
Nguyễn Văn Giang và cộng sự (2011), ứng dụng chỉ thị phân tử DNA để xác định và sàng lọc gen tms trong các dòng TGMS và trong quần thể phân ly F2, kết quả thu được dòng 103S, Pei ai 64S và 25S chứa gen tms2.
Sử dụng trong chọn tạo giống lúa lai hệ “hai dòng” trong điều kiện Việt Nam cần nhiệt độ chuyển đổi tính dục xung quanh 24oC là phù hợp, bất dục hoàn toàn và ổn định, khả năng nhận phấn ngoài cao, đồng thời có các đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng và chống chịu sâu bệnh đặc biệt là kháng bệnh bạc lá. Ngày nay, hiện tượng bất dục đực TGMS đã được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong công tác tạo giống và sản xuất lúa lai hệ hai dòng ở Trung Quốc cũng như Việt Nam. Nhiều tổ hợp lai có giá trị đã được tạo ra nhờ ứng dụng hiện tượng bất dục TGMS như Bồi tạp sơn thanh, Bồi tạp 49, Việt lai 20, TH3-3, Việt lai 24 (Nguyễn Thị Trâm và cs, 2010, 2011; Trần Văn Quang 2013; Vũ Văn Liết và cs, 2013).
* Dòng bất dục đực di truyền nhân cảm ứng với quang chu kỳ (PGMS)
Dòng PGMS là dòng mẫn cảm với quang chu kỳ biểu hiện bất dục và hữu dục hạt phấn. Hầu hết các dòng bất dục dưới điều kiện ngày dài (>13,5 h) và hữu dục dưới điều kiện ngày ngắn (<13 giờ). Ví dụ dòng N9044S và N5088S.
So sánh giai đoạn cảm ứng nhiệt độ của các dòng PGMS và TGMS các nhà khoa học kết luận rằng, giai đoạn cảm ứng của dòng PGMS bắt đầu sớm hơn so với dòng TGMS và giai đoạn cảm ứng nhiệt độ của dòng PGMS dài hơn so với dòng TGMS (Mou, 1998).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 Thời kỳ cảm ứng với độ dài ngày của các dòng PGMS xảy ra vào bước phát triển thứ 3 đến thứ 5 của đòng tức là khoảng 23-15 ngày trước khi lúa trỗ (Yuan, 1993). Pha cảm ứng của dòng Nongken58S cho biến đổi hữu dục xảy ra từ giai đoạn bắt đầu hình thành bông tới giai đoạn hạt phấn đơn nhân (khoảng 25-27 ngày trước khi trỗ) giai đoạn nhạy cảm nhiệt độ nhất là giai đoạn hình thành nhị và nhụy tới giai đoạn phân bào giảm nhiễm (Mou, 1998).
Tính trạng bất dục EGMS điều khiển bởi các gen chính, do vậy có thể chuyển vào một nền di truyền bất kỳ nào và để tăng đa dạng di truyền dòng mẹ EGMS. Điều này giúp giảm bớt rủi ro di truyền trong giống lúa lai. Khi không có gen phục hồi trong dòng bố của lúa lai hai dòng, hệ thống này lý tưởng để phát triển lúa lai indica/japonica vì Japonica không có gen phục hồi (Phạm Văn Ngọc, 2013).
Dòng PGMS cảm ứng với độ dài thời gian chiếu sáng trong ngày, các dòng HPGMS chọn từ quần thể giống Nongken58S (thuộc loài phụJaponica)
bất dục vào mùa hè khi ngày dài 14-16h và hữu dục khi độ dài ngày ngắn <13,75 giờ, cường độ ánh sáng tới hạn gây bất dục là 50 lux, độ dài ngày tới hạn gây chuyển đổi tính dục là 13 giờ 45 phút. Để phát hiện bản chất di truyền của gen cảm ứng quang chu kì người ta tiến hành lai dòng PGMS với các giống lúa thường thuộc loài phụ Japonica, kết quả thí nghiệm cho thấy con lai F1 hữu dục bình thường, F2 phân ly theo tỷ lệ 3 hữu dục: 1 bất dục đúng nhưđịnh luật Mendel, và kết luận rằng tính cảm ứng quang chu kỳ là do một cặp gen lặn (pms) điều khiển. Gen cảm ứng quang chu kỳ có bản chất di truyền giống như gen cảm ứng nhiệt độ (có thể đồng alen với gen tms), gen
pms hoạt động 2 chức năng: gây bất dục khi pha sáng trong ngày dài và khả năng hình thành hạt phấn hữu dục khi pha sáng ngắn xảy ra vào thời kỳ cảm ứng (12-18 ngày trước khi lúa trỗ bông).
Bằng chỉ thị phân tử đã chứng minh gen chính bất dục di truyền nhân cảm ứng ánh sáng ở Nongken 58S (Cặp lai Nongken 59S với dòng PTGMS
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
indica 3200S phát hiện hai locus gen pms1 và pms2 được nằm trên NST số 7 và 3. Hai locus khác ở cặp lai Nongken 58S với bố mẹ PTGMS có pms1 và
pms3 nằm trên NST số 12.
Các gen kiểm soát bất dục PTGMS ở các dòng japonica có nguồn là Nongken 58S mang alen của Nongken 58S, nhưng một số dòng indica không mang alen bất dục của Nongken 58S.
Trong các dòng PTGMS có nguồn gốc độc lập, có sự khác nhau cặp gen lặn điều khiển bất dục ở các dòng có nguồn gốc khác nhau (Weerachai M. et al, 2011), tính dục do nhiều nhân tố tác động nhưng chủ yếu là do nhiệt độ và độ dài chiếu sáng (Kubo T. Et al, 2011; Reflinur et al, 2012; Jihua Ding, 2012), một số kiểu gen bất dục : S1S1 S5S5, Nongken 58S; S2S2 S5S5, W6154S; S1S1 S4S4, W7415S; S2S2, Annong S-1; S3S3 S5S5, 5460S; S2S2 S5S5, W6154S (Virmani et al, 2003).
Tính bất dục do hiện tượng bất dục đực di truyền nhân cảm ứng với ánh sáng có tính ổn định khá cao do sựổn định về thời gian chiếu sáng trong ngày ở các mùa vụ cụ thể hay các địa phương cụ thể. Tuy nhiên, độ dài chiếu sáng trong ngày của Việt Nam rất khó sử dụng được những dòng bất dục đã có, dòng bất dục PGMS sử dụng trong điều kiện Việt Nam độ dài ngày chuyển hóa tính bất dục trong phạm vi 12 giờ 16 phút đến 12 giờ 30 phút là phù hợp (Vũ Văn Liết và cs, 2013).
Tính cảm ứng quang chu kỳ phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt độ, giới hạn nhiệt độ cao ảnh hưởng đến độ an toàn của quá trình duy trì bất dục trong điều kiện ngày ngắn, còn giới hạn nhiệt độ thấp lại ảnh hưởng đến quá trình sản xuất hạt lai trong điều kiện ngày dài. Để một dòng PGMS dễ dàng sử dụng thì giới hạn nhiệt độ dưới gây bất dục đực trong điều kiện ngày dài cần phải thấp và khoảng nhiệt độ mẫn cảm ánh sáng cần phải rộng.(Nguyễn Văn Hoan, 1999; Nguyễn Thị Trâm, 2000). Theo Nguyễn Văn Hoan (2006), giai đoạn mẫn cảm để chuyển từ hữu dục sang bất dục và ngược lại của dòng PGMS là
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 thời kì hình thành phân hóa mầm hoa đến thời kì hình thành tế bào mẹ hạt phấn là bước 3 đến bước 5 của phân hóa đòng, khoảng 15-21 ngày trước khi lúa trổ.
Các dòng bất duc đực mẫn cảm quang chu kỳ có thể nhân dòng trong điều kiện có quang chu kì ngắn, đồng thời có thể làm dòng mẹ bất dục để sản xuất hạt lai trong điều kiện ngày dài. Ở những vùng vĩ độ cao vào mùa hè ngày rất dài nên dễ dàng sử dụng dòng PGMS để sản xuất hạt lai F1. Khi nhân dòng mẹ cần bố trí ở những vùng có vĩđộ thấp hơn (Nguyễn Thị Trâm, 2002).
Ở Việt Nam nếu tìm được một dòng lúa cảm quang nào đó mà ngưỡng chuyển đổi tính dục vào khoảng 12h15’-12h30’ thì trong một năm sẽ có hai thời kì pha sáng trong ngày chuyển qua “ngưỡng”: vụ Xuân từ 1-11/4, vụ Mùa từ 3-13/9. Khoảng thời gian giữa hai ngưỡng (11/4-3/9) là 145 ngày có pha sáng dài trên 14h30’ dòng lúa đó sẽ bất dục, có thể bố trí sản xuất hạt lai F1. Còn khoảng thời gian từ 13/9-1/4 là 200 ngày, pha sáng ngắn dưới 12h15’ dòng sẽ hữu dục, có thể bố trí nhân để thu hạt tự thụ. Nếu dòng bất dục này chuyển đến các vĩ độ thấp hơn Hà Nội, ví dụ Cà Mau (80N) thì thời gian chuyển ngưỡng vụ Xuân sẽ muộn hơn (11/4-16/5), vụ Mùa sẽ sớm hơn (25/7- 3/9); hoặc đưa lên vĩ độ cao tại Hà Giang (240) thì thời gian chuyển ngưỡng vụ Xuân sẽ sớm hơn (27/3- 6/4), vụ Mùa muộn hơn (8-13/9) (Nguyễn Thị Trâm, 2008).
* Tiêu chuẩn một dòng EGMS tốt
Theo Yuan (1995), dòng EGMS tốt đòi hỏi phải có một số tính trạng và đặc tính sau đây .
- Phải có một số lượng cá thể đủ lớn ít nhất là 1000 cây đồng nhất, ổn định về các tính trạng nông sinh học.
- Số cây bất dục trong quần thể phải đạt 100% khi kiểm tra hạt phấn của từng cá thể bằng phương pháp hiển vi quang học hoặc bằng phương pháp bao
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 bông thì các cá thể này cũng hoàn toàn bất dục hoặc tỷ lệ phấn bất dục phải đạt 99,5%.
- Trong điều kiện tự nhiên sự biến đổi hữu dục phải rõ ràng, phải có thời kỳ bất dục kéo dài ít nhất 30 ngày liên tục. Trong điều kiện hữu dục thì dòng EGMS phải có tỷ lệ hạt mẩy ít nhất là 30%.