5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.2.1.Phân lập thể vùi tinh của virút NPV sau lây nhiễm trên tế bào
Các kết quả nghiên cứu ở các nước đều khẳng định liều lượng sử dụng NPV phải tính theo tổng lượng thể vùi cho 1 ha cây trồng, liều lượng thể vùi cần phun cho 1 ha cây trồng để trừ sâu hại tùy theo từng đối tượng sâu hại khác nhau, đối với sâu khoang và sâu keo da láng, tới 9,0 x 1011 OB/ha, còn đối với sâu xanh phải từ 1,5- 3,0 x 1012 OB/ha tùy theo loại cây trồng.
Như vậy, việc tạo dạng sản phẩm để sử dụng phòng trừ sâu hại chủ đích có thể có những khác nhau, nhưng nhiều tác giả đều khẳng định liều lượng sản phẩm sử dụng có thể nhiều hay ít tùy theo công nghệ tạo dạng, nhưng cần phải đảm bảo được số lượng thể vùi phun rải cho 1 ha đối với từng loài sâu hại cụ thể.
Công
thức Số thể vùitrước nhiễm(OB/ml) Sâu khoang (con) Tỷ lệ sâu chết 10NSN (%) nhiễm(OB/ml) Số thể vùisau TL1 1,50 x 108 150 91,84 a 4,20 x 108 a TL2 1,50 x 108 150 79,59 c 2,60 x 108 b TL3 1,50 x 108 150 83,67 b 2,35 x 108 c ĐC Nước cất 150 - - CV% 1,64 1,65 LSD 0,05 0,1133 3,1734
Ghi chú: NSN: Ngày sau nhiễm; ĐC: Đối chứng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 59
Điều đó đòi hỏi nguyên liệu thể vùi phải được định lượng một cách chủ động trước khi tạo dạng. Có như vậy mới có thể đảm bảo chế phẩm có chất lượng ổn định và hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại khi sử dụng trên đồng ruộng.
Theo Huda, et al. (2012) [24]; Lynn, et al. (2002) [29]; Nazli, et al. (2012) [32] thì SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) là một tác nhân tạo sủi trong việc phân lập thể vùi tinh từ dịch tế bào đã nhiễm vi rút NPV vì SDS có tác dụng giúp cân bằng sinh lý tế bào, không gây phá vỡ vỏ protein của thể vùi và chống hiện tượng kết mảng thể vùi sau khi phân lập thể vùi tinh.
Sajap, et al. (2000) [37] cho rằng sử dụng SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) để thu hoạch thể vùi tinh từ dịch nhiễm vừa có hiệu quả cao do chúng làm cho thể vùi tách rời nhau vừa dễ phân bố đồng đều trong phụ gia khi tạo dạng sản phẩm. Đồng thời, bằng kỹ thuật thu hoạch thể vùi tinh còn tạo điều kiện bảo quản lâu dài và dễ dàng vận chuyển đi xa đến nơi tiêu thụ sản phẩm mới tạo dạng mà chưa cần phải tạo dạng sử dụng sản phẩm ngay.
Để phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm, đề tài đã tiến hành nhân nguồn thực liệu vi rút NPV trên tế bào sâu khoang đã được nhân nuôi. Việc lây nhiễm được thực hiện theo phương pháp của Lynn, et al. (2003) [28] với chỉ số MOI (mật độ thể vùi/mật độ tế bào) là 0,1. Sau 4- 6 ngày tiến hành ly tâm phân lập để thu hồi thể vùi tinh theo quy trình ly tâm 4 lầnxen kẽ 2 lần nước cất vô trùng và 2 lần SDS, lần 1 với tốc độ 500 vòng/phút, lần 2 và 3 với tốc độ 1000 vòng/phút và lần 4 với tốc độ 500 vòng/phút để loại bỏ dịch tế bào và phân lập thể vùi tinh. Nguồn thực liệu thể vùi được sử dụng để tạo dạng sản phẩm hoặc đưa vào bảo quản ở nhiệt độ - 200C để chờ tạo dạng chế phẩm.
Kiểm tra nguồn thực liệu thể vùi tinh thu được sau lây nhiễm và phân lập theo công nghệ nhiễm trên tế bào sâu khoang đã nuôi nhân, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu kiểm tra cấu trúc trình tự gen của sản phẩm nhân sinh khối từ tế bào trên cơ sở áp dụng kỹ thuật PCR để phân tích.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 60
Hình 3. 3. Tế bào sâu khoang nhiễm NPV (A); Thể vùi tinh (B)
Kết quả gửi phân tích giải xây dựng cây phả hệ của cả 4 mẫu vi rút NPV- Spl thu được sau lây nhiễm trên tế bào và trên sâu non đã xác định trình tự gen của chúng hoàn toàn giống nhau (hình 3.4) và đều thuộc loàiSpodoptera litura Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV-Spl),giống Alphabaculovirus, họ
Baculoviridae với độ tương đồng 100% khi so sánh trình tự gen NPV- Spl trên ngân hàng GenBank.
Đồng thời, thuộc nhóm vi rút hoàn toàn có khả năng hình thành thể vùi như các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước lâu nay vẫn khẳng định. Kết quả phân tích đã khẳng định sản phẩm vi rút NPV sâu khoang được sản xuất bằng công nghệ lây nhiễm trên tế bào nhân nuôi.
Kết quả được trình bày ở hình 3.4và bảng 3.18 cho thấy cả 4 mẫu vi rút nhân trên tế bào và vi rút thu từ sâu non nhiễm bệnh đều cho kết quả phân tích hoàn toàn tương tự nhau. Điều đó cho thấy nguồn vi rút NPV sản xuất theo công nghệ nhiễm trên tế bào sâu khoang vẫn đảm bảo các đặc trưng di truyền của NPV sâu khoang. Đồng thời, cũng cho thấy hoàn toàn có thể nhân nguồn nguyên liệu vi rút NPV bằng cách nhiễm trên tế bào sâu khoang nhân nuôi để sản xuất chế phẩm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 61
Hình 3. 4. Kết quả phân tích PCR các mẫu NPV sâu khoang Bảng 3. 18. Các chủng NPVSpl sử dụng trong phân tích phả hệ
Nguồn phân lập Viết tắt GenBank Nguồn gốc
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene
Từ NPVSpl-2
đến NPVSpl-5 - Việt Nam
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene NPVSpl-6 - Việt Nam
Spodotera litura nuclear polyhydrosis
virus polh gene for polyhedrin SpltNPV-In X94437 Ấn Độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Spodoptera litura NPV gene for
polyhedron SpltNPV-Jap AB326102 Nhật Bản
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene SpltNPV-Kore DQ152923 Hàn Quốc
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene SpltNPV-Kore DQ350142 Hàn Quốc
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene SpltNPV-Ger AY706714 Đức
Spodoptera litura
nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene SpltNPV- Ger AY706715 Đức
Spodoptera litura nuclear polyhedrosis
virus polyhedrin (polh) gene SpltNPV-Aus AF068189 Australia
1 2 3 4 6
510 bp
M: Marker, 100 bp, Fermentas; 1: H2O (negative control); Mẫu 2- 5: NVP tế bào; Mẫu 6: NPV sâu non bị bệnh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 62
Spodoptera littoralis NPV gene for
nuclear polyhedron SpltNPV- Fra D01017 Pháp
Pieris rapae granloviruses PiraGV AY706673 -
Hình 3. 5. Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining.
So sánh trình tự gen polh với các đại diện từ Ngân hàng Gen. Mẫu vi rút NPV sâu khoang của Việt Nam được in đậm (mũi tên). Tên viết tắt được chỉ rõ ở bảng 1, mã số Ngân hàng Gen đặt trong dấu ngoặc đơn. Pieris rapae granuloviruses được đưa vào làm đối chứng. Gốc nhánh là giá trị thống kê bootstrap với 1000 lần lặp (chỉ ghi những giá trị lớn hơn 80%).
Thước đo khoảng cách di truyền 5%.