5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.3.4.Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV để phòng trừ sâu hại
Việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV sâu hại ở nước ta tập trung nhiều từ năm 1985 đến năm 2002 do 2 cơ quan là Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Bông Nha Hố (nay là Viện nghiên cứu cây bông) tiến hành.
Tại Viện Bảo vệ thực vật, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV được khởi xướng với sự giúp đỡ của các chuyên gia Liên Xô (cũ). Sau đó, được tiến hành với kinh phí đầu tư của chương trình CNSH kế tiếp nhau từ năm 1996 đến năm 2005 và 01 dự án bằng vốn hỗ trợ của Chương trình Bánh mì thế giới (Cộng hòa Liên bang Đức) giai đoạn 1990- 1995. Các đề tài, dự án đã thu được nhiều thành tựu to lớn và có giá trị thực tiễn cao đối với công tác bảo vệ thực vật ở Việt Nam. Đã nghiên cứu, xây dựng được qui trình sản xuất thức ăn nhân tạo nuôi sâu.
- Xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm NPV từ nguồn sâu non nhân nuôi Đã nghiên cứu kỹ thuật tạo dạng sử dụng chế phẩm dưới dạng bột thấm nước. Phối hợp với chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) tạo sản phẩm phổ rộng để phòng trừ sâu hại.
- Đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm ViHa và ViSL có hàm lượng 1,5 x 106 PIB/gam. Phòng trừ sâu hại trên su hào, cải bắp, lạc và thuốc lá tại các vùng ngoại thành Hà Nội, Vĩnh Phúc và Hà Tây (cũ), cho hiệu quả tốt.
Tại Trung tâm bông Nha Hố, cũng trong các năm 2000-2005, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV cũng được tiến hành khá mạnh mẽ theo phương pháp nuôi sâu kết hợp với thu thập nguồn sâu trên đồng ruộng. Sau đó đem về phòng thí nghiệm lây nhiễm vi rút và nghiền lọc lấy dịch thể chứa vi rút để sử dụng. Trung tâm đã sản xuất được từ 50- 100 lít/năm chế phẩm NPV dạng thô để phòng trừ loại sâu khoang và sâu xanh hại bông.
Việc sản xuất chế phẩm NPV theo phương pháp thu thập sâu non sâu khoang, sâu xanh bị nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng. Đem về nhà nghiền lọc,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 26
rồi đem nhiễm trên sâu nuôi trong phòng để tạo chế phẩm sử dụng để phòng trừ các sâu này trên đồng ruộng. Cách làm đó đã góp phần khai thác sử dụng nguồn lợi vi rút và các tác nhân gây bệnh cho sâu hại tự nhiên để phòng chống sâu hại cây trồng nông nghiệp.
Tuy nhiên, do thu gom sâu nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng làm thực liệu để lây nhiễm phát triển chế phẩm nên không thể khẳng định về tác nhân gây bệnh làm chết sâu. Vì vậy, chế phẩm sản xuất ra bao gồm cả vi rút NPV và các tác nhân gây bệnh côn trùng khác, nên chất lượng sản phẩm thường không ổn định. Ngoài ra, việc nhân nuôi sâu non để có số lượng lớn phục vụ sản xuất chế phẩm gặp rất nhiều khó khăn.
Tại Viện Bảo vệ thực vật, việc sản xuất chế phẩm NPV đề phòng trừ sâu đo xanh hại đay và sâu róm hại thông bằng 2 cách: Cách 1 là nuôi sâu non đến tuổi 3- 4 thì nhiễm NPV và thu hồi sâu chết, nghiền lọc lấy dịch đem sử dụng hoặc tạo dạng chế phẩm khô; Cách 2: thu sâu non ngoài đồng về nhiễm vi rút, rồi nghiền lọc và đem sử dụng (Nguyễn Văn Cảm và CS. 1996 [2]; Trương Thanh Giản và CS. 1996 [3], Hoàng Thị Việt và CS. 2002) [10].
Tuy nhiên, vào các năm sau đó thì cả 2 đơn vị này đều không sản xuất chế phẩm NPV tại chỗ, mà chuyển giao hướng dẫn kỹ thuật cho nông dân cách thu thập sâu non sâu khoang, sâu xanh bị nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng. Đem về nhà nghiền lọc, rồi đem sử dụng để phòng trừ các sâu này trên ruộng của chính mình. Hoạt động đó đã góp phần nâng cao đáng kể nhận thức và kỹ thuật cho nông dân trong việc sử dụng nguồn lợi vi rút tự nhiên để phòng chống sâu hại.
Từ kết quả nghiên cứu và sản xuất chế phẩm NPV sâu khoang và sâu xanh của 2 cơ quan nói trên. Nhận thấy để có thể sản xuất chế phẩm qui mô lớn theo phương pháp nuôi sâu cần phải giải quyết một số vấn đề liên quan đến điều kiện trang thiết bị sản xuất và hệ thống kiểm định chất lượng, cũng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 27
như hệ thống đảm bảo vô trùng phòng nuôi nhân sâu nguyên liệu.
Mặt khác, thực tế sản xuất chế phẩm đã gặp phải 2 cản trở lớn nhất về công nghệ. Trước hết là khả năng nuôi sâu số lượng lớn không thể đạt tỷ suất nhân như mong muốn và không thể chủ động, do tỷ lệ sâu chết bệnh cao và sức sống của sâu qua các đợt nuôi ngày càng kém. Đồng thời, chất lượng thức ăn sản xuất ra không ổn định, không đáp ứng yêu câu dinh dưỡng cho việc nhân nuôi sâu non.
Những khó khăn phát triển sản xuất chế phẩm NPV với qui mô công nghiệp như đã nói trên ở Việt Nam cũng hoàn toàn giống như các nước khác trên thế giới. Theo tổng kết của Grzywacz, et al. (1996)[23] thì có 3 vấn đề cản trở là:
1/ Khả năng sinh sản của sâu giảm nhanh qua thời gian nuôi;
2/ Các dụng cụ, thiết bị nhân nuôi sâu bị nhiễm vi sinh vật hại và vi sinh vật cạnh tranh với NPV làm chất lượng chế phẩm kém;
3/ Không thể cung cấp lượng lớn sâu noncó khối lượng đồng đều, có chất lượng ổn định.
Các tác giả cũng cho rằng có nhiều nguyên nhân không thể sản xuất chế phẩm NPV với qui mô công nghiệp, song có 6 nguyên nhân quan trọng nhất, đó là:
1/ Chất lượng sâu nuôi kém;
2/ Thực liệu NPV để lây nhiễm không đảm bảo;
3/ Liều lượng NPV lây nhiễm không thích hợp do kích thước sâu không đều;
4/ Kỹ thuật nuôi sâu rất khó cải tiến;
5/ Thu hồi sản phẩm không đúng lúc do sâu non phát triển không đồng đều nên mức độ lây nhiễm của vi rút trên sâu không triệt để;
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 28
Song với kết quả nghiên cứu thu được, các nhà nghiên cứu về bảo vệ thực vật ở Việt Nam cũng đều khẳng định vi rút nhân đa diện (NPV) là tác nhân gây bệnh khá phổ biến và có hiệu quả khá rõ rệt trên các loài sâu hại cây trồng ngoài đồng ruộng (Viện Bảo vệ thực vật, 2006) [13]. Tuy nhiên, những nghiên cứu chuyên sâu về vi rút NPV cũng như phát triển thành sản phẩm để phòng chống sâu hại còn ít và chưa được quan tâm đúng mức.
Nhận xét chung
Qua các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước có được cho thấy: + Ở nước ngoài: Việc nghiên cứu về vi rút côn trùng nói chung và vi rút sâu hại nói riêng được tiến hành từ lâu và trên nhiều khía cạnh, như thành phần, hình thái, sinh học sinh thái và cơ chế xâm nhiễm, gây chết côn trùng của vi rút NPV. Đặc biệt, các nước như Trung Quốc, Ấn độ, Mỹ, Anh, Pháp, v.v. phát triển mạnh việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học vi rút NPV qui mô công nghiệp theo công nghệ nuôi nhân tế bào.
+ Tại Việt Nam: Do điều kiện trang thiết bị chưa có điều kiện đáp ứng cho nghiên cứu chuyên sâu, nhất là trong nghiên cứu về vi rút nói chung và nghiên cứu NPV nói riêng. Đồng thời, việc nghiên cứu sản xuất ứng dụng NPV trong phòng trừ sâu hại cây trồng mới chỉ tập trung trong nghiên cứu khảo sát, đánh giá tiềm năng của tác nhân vi rút NPV, sản xuất tạo chế phẩm theo hướng thủ công với yêu cầu kỹ thuật công nghệ không quá cao. Tuy nhiên, định hướng nghiên cứu khai thác nguồn vi rút NPV đã được quan tâm nhiều trong những năm gần đây.
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 29
- Nguồn tế bào NPV sâu khoang do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp và được nuôi nhân tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Đấu tranh Sinh học.
- Các loại hóa chất dùng phân lập vi rút: Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)(Gibco), Tryphtose broth(Gibco),, Na2CO3, NaOH, nước cất hai lần, sacharose, v.v.
- Các loại môi trường nuôi nhân tế bàovà các môi trường phụ trợ trong nuôi nhân của hãng In-vitrogen (Mỹ) cung cấp. Bao gồm ExcellTM 420 serum free (Sigma), Schneider (Sigma), TC - 100 BML-TC/10 (Sigma), TNM- FH (Sigma), Grace (Gibco), v.v. Huyết thanh Fetal bovine serum (FBS) (Gibco), photphatse buffer saline pH 7,2 (1X) (PBS) (Gibco), dimethyl sulfoxide 10% (DMSO) (Gibco), trypan blue 0.4%, trypsin-EDTA 10X (Gibco), v.v.. của hãng In-vitrogen (Mỹ) cung cấp.
- Các loại kháng sinh đặc dụng, như: Gentamicine (50mg/ml) (Gibco), Streptomycin (1gram), Penicilin (1.000.000 IU), kháng nấm Fungizone (250µg/ml) (Gibco), dung dịch KCl 0,001%. Các hóa chất có liên quan như: cồn 70%, cồn 98%.
- Các phụ gia tạo dạng sản phẩm, gồm bột tan, khoáng Dolomite, bột sét.
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ nuôi sâu: lồng nuôi sâu, chậu nhựa, khay nhựa, đĩa petri, bocan, ống tuýp, pank, kéo, chổi lông, giấy thấm, bông thấm nước, v.v.
- Các dụng cụ phục vụ cho nuôi cấy, như: pipet man các mức, đầu côn và effendorf các loại, falcon loại 50ml và 15ml, bình nuôi cấy lọc khuẩn loại 25 cm2 và 75 cm2, v.v.
- Các thiết bị phục vụ thí nghiệm: Buồng cấy vô trùng, máy lắc để bàn N- Biotek (Hàn Quốc), máy li tâm 3.000 vòng/phút, tủ nuôi tế bào Binder (Mỹ), tủ lạnh sâu -800C, tủ lạnh thường, micropipette các loại 200µl, 1ml, 2ml, 5ml, kính hiển vi soi nổi Zeiss (Đức), kính hiển vi soi ngược Nikon Ti-U (Nhật
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 30
Bản), kính hiển vi quang học, buồng đếm hồng cầu v.v.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được tiến hành trong 2 năm 2013 và 2014, tại Trung tâm Đấu tranh Sinh học, Viện Bảo vệ thực vật, phường Đức Thắng, quận Bắc Từ Liêm, thành phố Hà Nội.
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Thu thập, phân lập và chọn lọc nguồn vi rút NPV sâu khoang có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang lực cao trong gây chết sâu khoang
+ Thu thập sâu khoang nhiễm NPV ngoài đồng ruộng
+ Phân lập, làm thuần và chọn lọc nguồn vi rút NPV sâu khoang có hoạt lực trừ sâu khoang caovà khả năng sinh thể vùi lớn
2.3.2. Nghiên cứu tạo dạng chế phẩm vi rút NPV từ nguồn vi rút được sản xuất trên tế bào sâu khoang nhân nuôi xuất trên tế bào sâu khoang nhân nuôi
+ Phân lập thể vùi tinh của vi rút NPV sau khi nhiễm trên tế bào sâu khoang nhân nuôi
+ Nghiên cứu tạo sản phẩm dạng bột thấm nước.
2.3.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV
+ Đánh giá hiệu quả gây chết sâu khoang trong phòng thí nghiệm + Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang ở ngoài đồng ruộng.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thu thập, phân lập và chọn lọc nguồn vi rút NPV sâu khoang có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang lực cao trong gây chết sâu khoang
Tiến hành điều tra thu thập các nguồn NPV gây chết sâu hại ngoài tự nhiên vào các cao điểm sâu hại phát sinh trên hành tỏi, rau thập tự và lạc tại các vùng nông nghiệp quanh Hà Nội và một số vùng khác theo phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật (Viện Bảo vệ thực vật, (1997) [11], (2000) [12]. Đặc biệt là các vùng có nguồn NPV tự nhiên có tiềm năng độc tính cao như
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 31
Hải Dương, Đông Anh, Sơn Tây. Dựa vào các triệu chứng đặc trưng của sâu khoang khi bị nhiễm bệnh nói chung và NPV nói riêng để thu thập mẫu sâu nhiễm bệnh. Sau đó đem về phòng thí nghiệm tiến hành phân nhóm nguồn sâu theo triệu chứng bên ngoài và lưu giữ ở nhiệt độ 2- 40C.
Đồng thời, tiến hành nuôi nhân sẵn số lượng lớn sâu khoang sạch trong phòng thí nghiệm. Sau đó, tiến hành nghiền và lọc riêng rẽ cho từng mẫu sâu nhiễm bệnh để lấy dịch phẩm. Sử dụng dịch phẩm nhiễm trên 50- 100 cá thể sâu khỏe đã chuẩn bị sẵn theo phương pháp nhiễm thức ăn để nhân và kết hợp tách lọc sơ khởi nguồn NPV theo triệu chứng nhiễm bệnh của sâu. Việc nhân thực liệu nguồn kết hợp tinh lọc tiến hành nhiều lần cho tới khi các cá thể sâu nhiễm từ cùng nguồn NPV có triệu chứng đặc trưng giống nhau.
Các nguồn thực liệu NPV được thu thập trên sâu khoang hại rau, lạc và đậu tương nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng sẽ được phân lập theo phương pháp như các tác giả Grzywacz,et al. (1996) [23]
+ Thí nghiệm 1: Thu thập và phân lập vi rút NPV từ các mẫu sâu khoang nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng, tiến hành qua các bước sau:
- Thu thập nguồn sâu nhiễm bệnh NPV tự nhiên ngoài đồng ruộng.
- Đưa về phòng nghiền lọc và ly tâm trong dung dịch SDS 0,1%.
- Ly tâm để tách SDS và thay bằng dung dịch sucarose nồng độ 65% để phân lập vi rút NPV.
- Phân lập vi rút từ vật chủ trong đó vi rút kí sinh là một bước quan trọng nghiên cứu chẩn đoán bệnh hoặc cho mục đích đặc biệt cần đến độ tinh khiết cao của hạt vi rút. Phương pháp phân lập gồm các bước sau:
Thu mẫu côn trùng bị bệnh cho vào cối, cho nước cất nước khử ion 2 lần hoặc đệm Tris, pH 7,3 – 8,0, nghiền, lọc bỏ bã. Lấy dịch lọc li tâm 500 vòng/ phút trong 5 phút, bỏ cặn, lấy dịch ly tâm (hình2.1):
Dịch ly tâm
Cặn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 32
Mỗi nguồn sâu thu được có triệu chứng đặc trưng của sâu nhiễm NPV sẽ được tiến hành phân lập để đánh giá hàm lượng thể vùi (OB) của nguồn thực liệu đó. Thí nghiệm phân lập làm thuần vi rút được tiến hành qua 3-4 chu kỳ nhân. Trong mỗi lần phân lập, đều tiến hành đánh giá hoạt lực gây chết sâu non sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm, với số lượng 50 cá thể sâu.
Sau khi phân lập được vi rút NPV thu được từ sâu khoang nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng, tiến hành nhiễm ngược trở lại sâu khỏe để kiểm tra mức nhiễm bệnh và thu vi rút NPV. Theo dõi hàm lượng thể vùi và tỷ lệ sâu chết sau các ngày nhiễm vi rút trên sâu.
Phương pháp xác định hàm lượng thể vùi: Tiến hành dùng micropipet lấy 1ml dịch thể vùi sâu khi đã được phân lập rồi pha loãng từ 2- 3 lần tùy theo hàm lượng thể vùi nhiều hay ít. Sau đó nhuộm màu bằng Tryphan Blue và kiểm tra mật độ thể vùi trên buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi. Đếm số lượng thể vùi có trong 5 ô nhỏ rồi tính trung bình.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 33
Sau đótính hàm lượng tế bào theo công thức như sau: Hàm lượng thể vùi (OB/ml) = (a x 4000 x 1000)/H
Trong đó:
a: số thể vùi trung bình có trong 1 ô nhỏ ( V=1/4000mm2) H: hệ số pha loãng
+ Thí nghiệm 2: Phân lập, làm thuần và tuyển chọn nguồn vi rút NPV sâu khoang
Từ nguồn thực liệu vi rút sâu khoang thu được từ đồng ruộng, tiếp tục tiến hành phân lập, làm thuần kết hợp lựa chọn các nguồn NPV có hoạt lực cao trên sâu khoang khỏe. Phương pháp phân lập, đánh giá được thực hiện theo phương pháp của Grzywacz,et al. (1996) [23].
Việcphân lập làm thuần kết hợp tuyển chọn lần thứ 1 bằng cách nhiễm vi rút trên sâu khỏe được nuôi bằng thức ăn sạchngay từ sau khi trứng nở để lựa chọn nguồn thực liệu vi rut NPV có hoạt lực cao và khả năng sinh thể vùi lớn.
Thí nghiệm được tiến hành với 4 công thức (CT) tương ứng với các nguồn thực liệu thu từ ngoài đồng và đối chứng. Cụ thể:
CT1: Thể vùi tinh của nguồn vi rút M1 được phân lập sau khi nhiễm trên sâu khỏe
CT2: Thể vùi tinh của nguồn vi rút M2 được phân lậpsau khi nhiễm trên sâu khỏe
CT3: Thể vùi tinh của nguồn vi rút M3 được phân lậpsau khi nhiễm trên sâu khỏe
CT4:Đối chứng không nhiễm vi rút NPV
Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc là 50 con sâu khoang