1 Haplorchistaichui Việt Nam HTAQT-VN Sán trưởng thành Người Nghiên cứu này 2 Haplorchis taichui Thái Lan H.ta-TH Metacercariae Cá EF05
3.2.5. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng HTAQT của Việt Nam với các loài sán lá dựa trên một phần trình tự gen co
Việt Nam với các loài sán lá dựa trên một phần trình tự gen cox1
Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ của chủng HTAQT với các chủng đại diện cho 10 loài sán lá, trong đó có sán lá ruột nhỏ đã xác định loài thu thận từ Ngân hàng gen, sử dụng một phần trình tự nucleotide (351 bp) gen cox1 được xây dựng bằng chương trình MEGA5.2 (Tamura et al., 2011). Kết quả xác định quan hệ phả hệ nguồn gốc của chủng HTAQT và 29 chủng thuộc 10 loài sán lá được trình bày ở Hình 3.8. HTA2HG-VN-cox1 HTAHG1-VN-cox1-JN809874 HTAQT8-VN-cox1-JN809879 H.ta-TH-cox1-EF055885 HTAQT-VN-cox1 HtDzH-VN-cox1 HTA8TH-VN-cox1 HTATH1-VN cox1-JN809909 HTATH6-VN-cox1-JN809896 HTAQT10-VN-cox1-JN809885 SfND-VN-cox1 Sf-TL-KF044301 CsHP8-CN-cox1-FJ965377 CsNA-VN-cox1-E U652407 Cs-KR-cox1-AF188122 Ov-CN-cox1-JF739555 OvLP-TH-cox1-EU022356 OvNG-LA-cox1-EU022358 H.pu-TH-cox1-KF044303 HspM4-VN cox1 HspM1-VN-cox1 Po-JP-cox1-U97214 Pw-TH-cox1-AB354225 Ph-VN-cox1-AB270677 Fh-ES-cox1-KF111595 Fh-TN-cox1-GQ231550 Fh-AUS-cox1-AF216697 Fg-NE-cox1-GU112468 Fg-CN-cox1-GU112474 Fg-CN-cox1-GU112475 41 100 100 76 100 99 100 98 99 96 53 97 86 67 43 89 99 46 45 0.05 Ia Heterophyidae II Opisthorchiidae Ib Heterophyidae III Paragonimidae IV Fasciolidae
Hình 3.8. Cây phả hệ biểu hiện mối quan hệ nguồn gốc giữa chủng sán lá ruột nhỏ HTAQT-VN của Việt Nam, với các chủng thuộc 10 loài sán lá khác nhau (có trong Ngân hàng gen), dựa trên trình tự nucleotide (351 bp) của gen cox1, sử dụng phương pháp kết nối liền kề (Neighbors-joining method) với hệ số tin cậy bootstrap là 1000 (Tamura et al., 2011). Ghi chú: 30 chủng đại diện cho 10 loài sán lá:được chia thành bốn nhóm: Nhóm Ia: bao gồm 10 chủng H. taichui trong đó chủng HTAQT-VN được đánh dấu bằng mũi tên màu đen; Nhóm II: các chủng thuộc bộ Opisthorchiid; Nhóm Ib: ba chủng H. pumilio; Nhóm III: ba chủng thuộc 3 loài trong giới Paragonimus; Nhóm IV: 6 chủng thuộc hai loài
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
trong giới Fasciola. Vạch ngang ở cuối hình biểu thị sai khác nucleotide của khoảng cách di truyền ở mỗi nhánh.
Kết quả phân tích phả hệ (dựa trên cây phả hệ ở Hình 3.8), cho thấy, các chủng sán lá của Việt Nam và thế giới được phân chia thành năm nhóm:
i) Nhóm thứ nhất bao gồm 12 chủng được chia làm hai nhánh: nhánh thứ nhất gồm 10 chủng thuộc loài H. taichui, trong đó bốn chủng của Việt Nam với dữ liệu chưa công bố (HTAQT; HtDzH; HTA2HG và HTA8TH) và sáu chủng tham chiếu trên Ngân hàng gen: một chủng của Thái Lan (Hta-TH, EF055885) và năm chủng của Việt Nam (HTAHG1: JN809874; HTATH1: JN809909; HTATH6: JN809896; HTAQT8: JN809879; HTAQT10: JN809885 thu tại Hà Giang, Thanh Hóa và Quảng Trị). Hai chủng SfND-NV-cox1 và SfTL-KF044301 thuộc loài S. falcatus
cũng thuộc nhóm này, nhưng chia tách thành một nhánh riêng biệt. Trong đó, bốn chủng HTAQT, HtDzH, HTAQT8 (JN809879) và HTAHG1 (JN809874) có quan hệ gần gũi nhất với chủng của Thái Lan, với mức độ đồng nhất về nucleotide trên 99% (Bảng 3.4)
ii) Nhóm thứ hai chứa các chủng thuộc họ Opisthorchiidae gồm hai giống:
Opisthorchis và Clonorchis;
iii) Nhóm thứ ba chứa các chủng thuộc loài H. pumilio, gồm 2 chủngcủa Nam Định (HspM1 và HspM4) cùng với một chủng của Thái Lan (Hpu-TH, KF044303). Tuy nhiên, các chủng H. pumilio của Việt Nam có tỷ lệ đồng nhất không cao so với chủng Thái Lan (90%) (Bảng 3.4);
iv) Nhóm thứ tư chứa các chủng thuộc họ Paragonimidae gồm ba loài
Paragonimus ohirai, P. heterotremus và P. westermani;
v) Nhóm thứ năm chứa các chủng thuộc giống Fasciola gồm hai loài: F. gigantica và F. hepatica.
Như vậy, kết quả phân tích phả hệ ở trên có sự phù hợp với kết quả phân tích thành phần và tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide một phần gen cox1 (351 bp). Các kết quả trên cho thấy chủng sán lá ruột nhỏ phân lập trên người nhiễm, tại Quảng Trị (Việt Nam), thuộc về loài Haplorchis taichui, có vị trí phân loại là: Eukaryota;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Metazoa; Platyhelminthes; Trematoda; Digenea; Opisthorchiida; Opisthorchiata; Heterophyidae; Haplorchis; Haplorchis taichui.
Đặc biệt, các kết quả phân tích trên cũng cho thấy, gen cox1 trong hệ gen ty thể của loài sán lá ruột nhỏ H. taichui, có thể được lựa chọn như là một chỉ thị di truyền phân tử trong công tác giám định, phân loại và chẩn đoán loài sán gây bệnh ở người này, cho độ chính xác và tin cậy cao. Qua đó, dựa trên trình tự gen cox1 có thể nghiên cứu xây dựng qui trình kĩ thuật phục vụ công tác chẩn đoán, giám định loài hoặc điều tra nhanh dịch tễ sán lá ruột nhỏ H. taichui, giúp cho việc điều trị và phòng chống dịch bệnh hiệu quả.
ấu trúc bậc hai của RNA vận chuyển amino acid Threonin (tRNA-Thr) và Tryptophan (tRNA-Trp)
Bằng chương trình tRNAscan - SE (Lowe và Eddy, 1997), bốn gen tRNA (RNA vận chuyển), cấu trúc bậc hai của chúng được xác định. Mô tả cấu trúc bậc hai của RNA vận chuyển được trình bày ở hình 3.9, vận chuyển amino acid Threonin (hình 3.9A) và amino acid Tryptophan (hình 3.9B), xác định bằng phần mềm tRNAscan–SE, có tại http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.9. Cấu trúc bậc hai của tRNA của H. taichui.
Ghi chú: A: tRNA-Thr; B: tRNA-Trp
Kết quả ở hình 3.9A và hình 3.9B cho thấy:
- Cấu trúc bậc hai của tRNA có cấu trúc điển hình ”lá sồi” (clove-leaf), đặc trưng và phù hợp với các chức năng vận chuyển amino acid của tRNA.
- Mỗi tRNA đầy đủ có 4 cấu trúc (hay còn gọi là cánh tay) chính (tính từ đầu 5'):
+ Cánh tay amino acid (amino acid arm): Gồm 7 cặp nucleotide bắt cặp nhau hoàn chỉnh hoặc không hoàn chỉnh tạo nên “kẹp tóc” (hairpin); ở đầu 3‟ cuối cùng nhô ra một nucleotide. Vùng tiếp nhận amino acid là đoạn mạch thẳng gồm 8 nucleotide; ở tRNA-Thr vận chuyển Threonine là CACCCUCU; ở tRNA-Trp vận chuyển Tryptophane là GUUUGUUG (Hình 3.9A,B).
+ Cánh tay DHU, dihydrouridine arm (DHU-arm): có “kẹp tóc” gồm 4 nucleotide bắt cặp và một “vòm” (DHU-loop) dài ngắn khác nhau, chức năng nhận biết aminoacyl-tRNA synthetase;
+ Cánh tay anticodon (đối mã) (Anticodon arm): có “kẹp tóc” gồm 5 nucleotide bắt cặp và một “vòm” (anticodon-loop) đối xứng chứa đối mã gồm 3 nucleotide với bộ mã của amino acid mà tRNA này vận chuyển. Ví dụ: Ở tRNA-Thr (Threonin), có đối mã là UGU vận chuyển Threonin (bộ mã: ACA) (Hình 3.9A). Vòng anticodon đọc mã trên mRNA (RNA thông tin) bằng sự kết cặp anticodon- codon (theo nguyên tắc bổ sung) nhưng có sự thay đổi linh hoạt giữa các tRNA vận chuyển amino acid khác nhau: tRNA-Thr anticodon là bộ ba nucleotide UGU, còn ở tRNA-Trp là UCA;
+ Cánh tay TPsiC (TΨC, (Psi, pseudouridine): có “kẹp tóc” gồm 2-4 nucleotide bắt cặp và một “vòm” (TΨC-loop) dài ngắn khác nhau, nhận biết ribosome;
Các kết quả trên chứng tỏ, các tRNA của chủng sán lá ruột nhỏ HTAQT thuộc loài H. taichui trong nghiên cứu này, có cấu trúc và sắp xếp cơ bản giống với tRNA
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
của các loài sán dẹt. Điều này cũng có ý nghĩa suy đoán rằng cấu trúc và sắp xếp tRNA có sự giống nhau giữa các loài sán dẹt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/