Thiết kế mồ
CHUI THU NHẬN TẠI QUẢNG TRỊ
3.1.1. Kết quả thu nhậ 2,9 kb của hệ gen ty thể H. taichui
* Kết quả thu nhận sản phẩm DNA sau phản ứng PCR:
- Mẫu H. taichui thu nhận tạ , ký hiệu HTAQT, được tách chiết DNA tổng số bằng bộ sinh phẩm AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER, Hàn Quốc), theo quy trình đã trình bày ở chương 2.
- Đoạn DNA hệ gen ty thể có độ dài 2,9 kb của chủng H. taichui (HTAQT), sử
dụng cặp mồi HTA6F-HTA4R đã được thu nhận, vớ ệt
được trình bày ở bảng 2.2. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1%. Kết quả được trình bày ở hình 3.1.
2,3kb 4,3kb 6,5kb
~2,9kb M 1
Hình 3.1. ận chuỗi gen ty thể của mẫu HTAQT sử dụng cặp mồ
– 2,9 kb. Ghi chú: M: Chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn
thể Lambda được cắt bằ . Mũi tên chỉ sản phẩm DNA của phản
ứng PCR.
Kết quả trên hình 3.1 cho thấ chuỗi gen ty thể của mẫu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thước khoảng 2,9 kb tương ứng với kích thước dự kiến thu nhận với cặp mồi thiết kế. Kết quả này chứng tỏ quá trình thiết kế mồi, tách chiết DNA tổng số, thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR là chính xác, cho sản phẩm DNA sau phản ứng PCR hoàn toàn đặc hiệu với kích thước dự kiến của cặp mồi thiết kế. Sản phẩm DNA nói trên được tinh sạch làm nguyên liệu cho quá trình dòng hóa.
* Kết quả dòng hóa sản phẩm PCR:
- Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra được tinh sạch bằng bộ hoá chất PCR Purification Kit (BIONEER, Hàn Quốc) và được dòng hóa vào vector pCR2.1TOPO (TA-cloning Kit) của hãng Invitrogen, sau đó được chuyển nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α-T1. Sản phẩm sau chuyển nạp được nuôi cấy trên đĩa thạch LB-agar 1,5% có bổ sung X-gal và Kanamycin, ủ ở 37oC trong 18 đến 20 giờ.
- ấ ả các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh.
Khuẩn lạc màu trắng là khuẩn lạc có khả năng mang vector tái tổ hợp mong muốn. Chọn lọc theo cơ chế kháng sinh và theo cơ chế X-gal, lấy 3 khuẩn lạc nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có kháng sinh Kanamycin, lắc 200 vòng/phút ở 370
C, trong 16 - 20 giờ. Tế bào tái tổ hợp được thu bằng cách ly tâm và tách chiết DNA plasmid bằng bộ sinh phẩm DNA Plasmid Mini Extraction Kit của hãng BIONEER. Cắt kiểm tra sản phẩm DNA plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI và điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%, kết quả được trình bày ở hình 3.2.
4,3 kb 2,3 kb 2 kb M 1 2 3 3,9 kb 2,9 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI. Ghi chú: M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lambda cắt bằng enzym HindIII; 1, 2, 3: DNA plasmid tái tổ hợp đoạn gen 2,9 kb của hệ gen ty thể chủng HTAQT cắt bằng enzym EcoRI.
Kết quả điện di ở hình 3.2 cho thấy, tại cả 3 giếng 1, 2, 3 đều có chứa 2 băng sáng DNA, một băng có kích thước khoảng 3,9 kb tương ứng với kích thước của vector pCR®2.1-TOPO và một băng có kích thước khoảng 2,9 kb tương ứng với đoạn DNA từ sản phẩm PCR cần tách dòng. Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp sau tách dòng, được chọn làm mẫu nguyên liệu cho giải trình tự DNA.
* Kết quả giải trình tự DNA:
Plasmid tái tổ hợp được gửi giải trình tự tại Hàn Quốc (Macrogen, Hàn Quốc).
- ộ dài tương đối lớn, nên các mồi bám nộ
3F-JB4,5R (Bảng 2.1) được sử dụng để giải trình tự, thu từng đoạn DNA lồng vào nhau. Các đoạn DNA này lồng vào nhau khoảng 100 bp-150 bp, để khi giải trình tự vẫn thu nhận được các chuỗi nucleotide tiếp nối nhau để xử lý thu nhận toàn bộ chuỗi nucleotide có độ dài 2,9 kb. Trình tự nucleotide chuỗi gen ty thể DNA dài 2,9 kb của chủng HTAQT và vị trí bám của cặp mồi HTA6F-HTA4R, được trình bày tại hình 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ HTA6F> GTGAATAAGGGTTATGTCGAGTGAAGCTACTAGGGGTTAGATGTGTGAGAGCTATGTGAAGCTGTTGCTGCTAACAATGGTAAGAGTGTTTAA AGCGCTCGGCTCTCTTGTAGGGAACAATCTAGGTTAAGTAGAGACTGTCTGTCTTCAAAACAGAGGGTAGCTTGCGCTGTTTGTTGTTAGATG TTGACTTGATTATTGACTTTGGATCATAAGCGAATAGGGTTGATATATATGATTGTTGGAGTGTGAGGGGGCTTTTTAGGTCTTTCTTTGAGG TTTTTGATCCGTGTTAACTACTTGGATCCTTACTATAATGTTGTATCCCCAGAGGTTTATAATTATGTAATTACTAGGCATGGTATTGCGATG ATTTTTTTTTTCTTAATGCCGGTTTTGATTGGGGGGTTTGGAAAATATCTGTTGCCCCTGTTGTTGGGGCTTCCTGATTTGAATTTACCCCGT TTAAATGCCCTTAGAGCTTGGTTAATGATTCCTTCTGCTGTTTGTTTTGGGTTAAGTATGTTTGGGGGGTCTGGGGTTGGCTGGACTTTTTAT CCCCCCCTGTCTTCTAGGGATTATAGGGGTTGGGGTGTTGACTTTCTTATGTTTTCTTTACATTTGGCGGGGTTATCTAGTCTGTTTGGTTCT TTAAACTTTATTTGTACAATAATGAGGGCTATGAGTAATGATACCAGGGAGCGGTACTCTATTGTGGTTTGGGCTTATTTGTTTACTTCTATT CTTTTGTTGCTTTCGTTACCAGTGCTAGCTGCGGGTATAACGATGCTTTTGTTTGATCGTAGATTTAGCTCTTCTTTTTTTGATCCATTGGGA GGGGGGGACCCTGTCTTGTTCCAGCATATGTTTTGGTTTTTTGGGCACCCCGAAGTTTACGTTCTTATTCTCCCAGGGTTTGGTATAGTGAGA CACATTTGTAGGACGTTAACAAATAAAGATTCCTTGTTTGGTTATGGGGGTTTAGTTCTTGCTATGTTTTCTATAGTCTGTTTGGGGAGTGTT GTTTGAGCTCATCATATGTTTATGGTTGGGTTGGATGTTAAGACGGCTGTTTTTTTTAGTTCTGTGACCATGGTTATAGGAGTCCCCACAGGT ATAAAGGTTTTTTCTTGGCTGTATATGTTGGCGGGAAGTCGGGGCCGGTTTTGGGATCCGATAATGTGGTGGATATTGGGTTTTATTGTCTTA TTTACTATCGGGGGGGTGACCGGGATTGTGTTGTCTTCTTCTATAATGGATACTTTGTTGCATGACACTTGATTTGTAATAGCTCATTTTCAT TATGTTCTTTCTTTAGGTTCTTATATGTCgGTGGTGATATCTATGATTTGATGATGGCCTGTGATAGTGGGTTATAGGTTGAAAAAGTACTTG TTGATGGCTCATTGGGGGGTGTCAATGGTTGGATTTAATTTGTGTTTTTTTCCTATGCATTTTTTAGGGTTTCAGGGTTTACCTCGTCGGGTG TGTGTTTATGAGCCTTGTTTTCAGTGGTTGAAAACTATGGCTAGGCTGGGGGGACTTCTTTCTGTTTTTAGGGGGTTTATGTTAGCTTTCATT TTATGAGAGTCGTTGTCTGTGGGTAATCGGGTGATAGGGTTATGGGGTAGTAAAGCCTTGGTTTTAAAAGTAGTAACTTCTCCTGTGCCGCAT CATTGTAGTTATATGAGTGAGCCGGTAACGTGGTTTTATCGTTGGTATTAGAGGGTGTATTTTAAGGAAGTAGAATGTAGCTTTTGTAAGGCT AAGGTGCTGGGGTCACCCTCTGGTTTATAGGCTGGTTAGGTGCTTATTTCTGGGTTTATTTTACCTTTTGCATCATGATTCCTTGAGAGATTC CTTGTATAAGGGGTTCCGAAGTGCAGAGATTTCCTTTTGGTTAGCTTAGTGCTGTAGTTTTGGGCGGGTAGCCTTTGTTAAAGTCATTGGGGG AGGTGAAACATAAATCGTTCTGCTCGATATCTGATTTTTGCTAGGGTTTTCTTGGGATCCTTGTTGTTTGGAAATGATGGGGAGGGTAAGAGT CTTGCTGTGTTATTGATGGATTTAGGTTAGAGGTACCTTTTTGTTGTACTATGTGTTAAGACTGGGTAACTTAGCCTGTTGAGAGATACTTTG TTGGGGCTAGCAGAGGTTTAATTTTGTGTCGTGAGTATGAGGGAATAAGTAGTTTTATTAGCTCTCTCTTTTCTCGGGTGCCTCCGGTCTGTT TATTAAAAACATTTCCATTAGTAAGGATTAATGGTAGTACCTGCCCGATGTAATAATGAATGGCCGCAGTATCTTGACTGTGCTAAGGTAGCA TAATTAGTTGCCTCGTAATTTGGGGATTGTTTGAATGGTTTGACTTGGGGGTTTATCTAGGTGGGGGCTTTGTTGCGAAATTGGTTGATCAGT GCAGAATCTGATCCTTTTTGATTAGACGGAAAGACCCCGAGAGCTTGCAGTAGGATGTTTTATCTGGGGAGGAGGCAAATGTTTCATTTGTTT TTAGACCCTTTTGGGTAAAAGATTGAAGTTACCTCGGGGATAACTAGGTAAGAAGCAAGGAGAGGCCTTATTGATTTGCTTGGTTGCCATCTC GATGTTGACTTAGGATGTAGCGGAAGGGTGTAGCAGTTTTTCTGGTTGGTCTGTTCGACCTTAGAATCCTTCATGAGTTGAGTTAAGACCGGC GAGAGCCAGGTCGGTTCTTATCTATCTTTGTTGGAGGTTAGTACGAAAGGATTATCTCTAATTAATGTTTGGGTGTGATGCTAGTAAGGCAGG GTGCTCTGCAAAGGCACTTTAGATATTTTTATCCATACCTTATTTATTTAGCTTTGGTTATGGAAGTTTCTCGTGAGCGGTCTACA <HTA4R
Hình 3.3. Diễn giải trình tự nucleotide vùng gen đích có kích thước 2876 bp trong hệ gen ty thể chủng HTAQT sau giải trình trình tự. Ghi chú: Mồi xuôi HTA6F và mồi ngược HTA4R được đánh dấu ở phần đầu và phần cuối của chuỗi gen đích.
- Kết quả ở hình 3.3 cho thấy, trình tự nucleotide của chuỗi gen sau giải trình tự là liên tục, rõ ràng, có chứa trình tự mồi xuôi (HTA6F) và mồi ngược (HTA4R) ở phần đầu và cuối chuỗi gen, đúng với trình tự mồi thiết kế. Như vậy, trình tự đoạn gen đích cần nghiên cứu trong hệ gen ty thể của chủng sán lá ruột nhỏ HTAQT đã được thu nhận. Quá trình thiết kế mồi, thực hiện phản ứng PCR, dòng hóa và giải trình tự DNA của đoạn gen đích nghiên cứu có kích thước lớn (2,9 kb), trong hệ gen ty thể của chủng sán lá ruột nhỏ HTAQT đã được thực hiện thành công.