Thiết kế mồ
2.3.5.Phƣơng pháp kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên thạch agarose
* Nguyên lí:
Dựa trên tính chất hoá học của acid nucleic là: các acid nucleic mang điện tích âm trong môi trường pH trung tính do đó các gốc phosphat ở khung phosphatdieste trong cấu trúc hoá học, dưới tác dụng của điện trường không đổi chúng di chuyển về cực dương và dừng lại ở điểm có pH đẳng điện (pHi) đặc trưng của mỗi loại phân tử acid nucleic, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử acid nucleic (loại có trọng lượng phân tử lớn di chuyển chậm hơn loại có trong lượng phân tử nhỏ) và môi trường điện di. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng xanh bromophenol và soi dưới tia cực tím so sánh với chỉ thị phân tử DNA.
Có 2 loại gen sử dụng trong kĩ thuật điện di nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử là: Gel agarose sử dụng trong các máy điện di và gel polyacrylamide sử dụng phân tách các phân tử acid nucleic kích thước nhỏ trong giải trình tự DNA.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chỉ thị phân tử DNA thường được dùng là DNA của thực khuẩn thể Lambda, dài 43kb được cắt bằng enzym giới hạn HindIII thành 8 phân đoạn có độ dài: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb; 0,125kb. Nhờ chỉ thị phân tử DNA có thể xác định được chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu.
* Tiến hành:
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% sử dụng Bộ điện di DNA (Bio-Rad) và chụp hình sản phẩm điện di trên Máy soi gel và chụp ảnh Dolphin-DOC (Wealtech-Mỹ).
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị gel agarose 1%: Lấy 0,4 g agarose nguyên chất (dạng bột), cho vào cốc đong thuỷ tinh chịu nhiệt đổ vào đó 40 ml dung dịch TAE 1 lần (TAE có thành phần gồm: Tris, acid acetic glacial, EDTA), cho vào lò vi sóng đặt nóng chảy trong 3 phút sao cho agarose 1% tan chảy hết. Đổ thạch đã tan chảy vào hệ thống điện di, gài lược có nhiều răng, đổ thạch ngập răng lược khoảng 0,5 cm và để nguội ở nhiệt độ phòng (khoảng 60-90 phút). Khi nguội các răng lược tạo thành các lỗ để tra mẫu vật vào kiểm tra.
- Dìm ngập khay thạch trong hộp điện di chứa đệm TAE 1 lần.
- Tra mẫu: Lấy 10 µl sản phẩm PCR trộn với 2 µl chỉ thị màu (xanh Bromophenol) tra riêng biệt vào từng giếng.
- Tra chỉ thị phân tử: Lấy 6 µl chỉ thị phân tử DNA marker, ở đây chúng tôi sử dụng DNA của thực khuẩn lambda cắt bằng enzyme giới hạn HindIII.
- Chạy điện di ở 100V trong thời gian khoảng 30 – 35 phút.
- Phát hiện DNA của sản phẩm PCR nhuộm gel trong dung dịch Ethidium Bromide (2µg/ml) trong 15 phút.
- Rửa gel bằng nước cất sau đó đưa bản gel lên soi qua tia cực tím và chụp ảnh.