Thiết kế mồ
2.3.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số của sán lá ruột nhỏ được tách chiết bằng bộ kit sinh phẩm “AccuPrep®
Genomic DNA Extraction Kit” (hãng BIONEER, Hàn Quốc).
* Nguyên lý tách chiết DNA tổng số:
Mẫu sán sau khi xử lý được nghiền trong bộ cối chày nhựa, nhằm phá vỡ mô và tổ chức. Huyễn dịch thu được bao gồm các thành phần: tế bào, protein hoặc có thể có RNA nên cần phải loại bỏ chúng. Loại bỏ protein bằng cách bổ sung enzym proteinase K có tác dụng phân huỷ protein, và bổ sung RNase A có tác dụng phá hủy RNA. Sau đó, phá vỡ màng tế bào thu nhận hỗn dịch gồm DNA và các thành phần khác của nguyên sinh chất. Tách riêng và thu nhận DNA tổng số, bao gồm: DNA hệ gen nhân và DNA hệ gen ty thể, bằng isopropanol và lọc trên màng lọc tích điện dương. DNA sau thu nhận được kiểm tra hàm lượng và bảo quản ở -20o
C, để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen cần nghiên cứu với các cặp mồi đặc hiệu (Lê Thanh Hòa, 2002).
* Cách tiến hành với bộ kit “AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit”:
Bước 1: Mẫu vật sau khi xử lý được nghiền trong bộ cối chày nhựa
Bước 2: Thêm 200 µl dung dịch Tissue Lysis buffer (ATL) và tiếp tục nghiền cho đến khi thành dung dịch đồng nhất. Bổ sung 20 µl Proteinase K (50mg/ml), ủ 60oC trong 3 giờ cho đến khi mô được phân hủy hoàn toàn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bước 3: Bổ sung 4 µl RNase – A (100mg/ml) và 200 µl dung dịch Binding buffer (AL hoặc GC), lắc mạnh rồi ủ ở 70oC trong 30 phút
Bước 4: Thêm 200 µl dung dịch Izopropanol (96 - 100%), rung lắc trong 15 giây. Sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 5: Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang cột có màng lọc, ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ phần dung dịch cặn.
Bước 6: Thêm 500 µl dung dịch Washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc để rửa DNA bám vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới.
Bước 7: Thêm 500 µl dung dịch (Washing buffer 2) AW2 vào cột lọc để rửa DNA bám vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới. Ly tâm lại 13000 vòng/phút trong 1 phút (để làm khô màng).
Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf 1,5 ml mới, thêm 60 µl dung dịch Elution buffer (EL), để ở nhiệt độ phòng trong 2-5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Bỏ cột, giữ lại dịch bên dưới.
Ghi kí hiệu mẫu và bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng.
2.3.
Đoạn gen của hệ gen ty thể sán lá ruột nhỏ H. taichui chứa các RNA vận
chuyể nad3, cox1, 16S RNA ribosome là đoạn
gen đích chúng tôi lựa chọn để thu nhận, nhân gen và giải trình tự để so sánh với các loài sán lá ruột nhỏ và các loài sán lá khác.
Các mồi được thiết kế dựa trên trình tự bảo tồn các gen có trong Ngân hàng gen. Mồi đặc hiệu HTA6F, HTA1F - HTA2R, HTA4R được thiết kế dựa trên đoạn gen chạy bằng cặp mồi JB3F – JB4,5R (Bảng 2.1) nằm trong gen cox1.
Bảng 2.1. Trình tự thiết kế mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) Độ dài (mer)
HTA6F GTGAATAAGGGTTATGTCGAG 21 HTA1F TCTTATTTACTATCGGGGGGGTGAC 25 JB3F TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT 24 JB4,5R TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG 24 HTA2R TCAAACAACACTCCCCAAACAGAC 24 HTA4R GAAGTTTCTCGTGAGCGGTCTACA 24
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/