Thiết kế mồ
2.3.7. Dòng hóa DNA sản phẩm PCR
* Nguyên lí của dòng hoá
ắn nối (ligation) một đoạn DNA ngoại lai (thường là sản phẩm PCR/RT-PCR) vào trong hệ gen của một vòng DNA đã được thiết kế sẵn gọi là plasmid mang (hay vector dẫn truyền), tạo ra vector tái tổ hợp và được chuyển nạp (transformation) vào tế bào chủ thích ứng (thường là tế bào E. coli thuần chủng) tạo dòng tái tổ hợp. Sau khi chuyển nạp tiến hành nuôi cấy để nhân lên và chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp theo hai cơ chế: cơ chế X-gal và cơ chế kháng sinh loại trừ những vi khuẩn không tái tổ hợp, nhằm thu được số lượng lớn các bản sao DNA ngoại lai (vector tái tổ hợp). Tách chiết các khuẩn lạc đơn dòng để thu lượng DNA ngoại lai được nối vào vector bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn (restriction enzyme) (Lê Thanh Hòa, 2002).
* Nối sản phẩm PCR vào plasmid vector:
Do sản phẩm PCR (sử dụng enzyme Taq DNA polymerase xúc tác tổng hợp) thông thường được gắn thêm Adenine (A) ở đầu 3‟, nên khi nối với vector có đầu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lồi là Thymine (T) đã được các hãng sinh phẩm thiết kế từ trước, thì hai nucleotide này sẽ gắn nối bổ sung cho nhau nhờ enzym nối T4-DNA ligase hoặc enzym topoisomerase. Các vector thường được sử dụng để nối ghép (ligation) sản phẩm PCR/RT-PCR vào vector là pCR2.1 hay pCR2.1®TOPO (Invitrogen) ( 2.2).
2.2. ®2.1-TOPO® (Invitrogen)
Vị trí để nối sản phẩm PCR vào được bố trí ở trong chuỗi gen lacZ, gen mã hóa và sản xuất enzym β-galactosidase, có tác dụng xúc tác thủy phân một loại hóa chất có tên gọi là X-gal để tạo nên các dẫn chất có màu xanh. Vi khuẩn không mang plasmid tái tổ hợp sẽ tạo nên khuẩn lạc màu xanh. Khi sản phẩm được nối vào vị trí nối thành công, thì đoạn DNA ngoại lai làm bất hoạt gen lacZ không cho nó sản xuất ra enzym β-galactosidase, và do vậy vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp sẽ không có enzym phân hủy cơ chất X-gal và khuẩn lạc sẽ mang màu trắng khi nuôi trên môi trường có chứa X-gal.
Thành phần của phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector pCR®2.1-TOPO được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector pCR® 2.1-TOPO
Thành phần phản ứng Thể tích
H2O 5 μl
Buffer ligation 10X 2 μl
Sản phẩm PCR 1 μl
Vector pCR 2.1-TOPO (25ng/ μl) 1 μl
T4DNA ligase (4U) 1 μl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Chuyển nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến:
Quá trình chuyển nạp theo các bước sau:
Bước 1: Lấy 5 μl sản phẩm nối nói trên cho vào 50-100 μl tế bào khả biến E. coli DH5α (108 – 109 tế bào/ml), ủ trên đá trong 45 phút.
Bước 2: Sốc nhiệt ở 420
C trong 45 giây, rồi ngay lập tức ủ vào trên đá trong 2 phút.
Bước 3: Bổ sung thêm 150 μl môi trường dinh dưỡng SOC, lắc ống tế bào với tốc độ 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 370C để các tế bào ổn định và nhân lên trong vài chu kỳ đầu.
Bước 4: Sản phẩm chuyển nạp được trải đều trên đĩa thạch LB-agar (Luria – Bertani) 1,5% có bổ sung 100 μl kháng sinh Kanamycin (40mg/ml) và 200 μl X-gal (40mg/ml), ủ các đĩa thạch ở tủ ấm 370C ít nhất là 18 - 20 giờ.
Sau thời gian trên, tiến hành chọn lọc và nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp.
* Chọn lọc khuẩn lạc và nuôi cấy trong môi trường lỏng: + Cơ sở lý thuyết:
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp thực hiện bằng 2 phương pháp: chọn lọc theo phản ứng cơ chất (với X-gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp thành công vector tái tổ hợp và chọn lọc theo phương pháp kháng sinh nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp được bất kỳ vector và các loại vi khuẩn tạp khác.
- Theo cơ chế X-gal:
Chọn những khuẩn lạc có màu trắng mang vector tái tổ hợp, không chọn những khuẩn lạc có màu xanh. Vi khuẩn E. coli không chứa plasmid tái tổ hợp thì sẽ có gen lacZ hoàn chỉnh sản xuất enzym β-galactosidase và sẽ phân hủy cơ chất X-gal có trong môi trường tạo nên dẫn xuất indol, dẫn xuất này ngoài môi trường sẽ bị oxy hóa cho màu xanh. Nếu có đoạn DNA ngoại lai (DNA của PCR nhân vùng gen mong muốn) xen vào giữa gen lacZ thì gen này sẽ bị bất hoạt, enzym β- galactosidase không được sản xuất vì thế mặc dù có X-gal trong môi trường nhưng cơ chất này không bị phân hủy, không tạo nên dẫn xuất indol và khuẩn lạc có màu trắng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Theo cơ chế kháng sinh:
Tế bào E. coli nguyên thủy không tiếp nhận được plasmid tái tổ hợp khi nuôi cấy trên thạch cho dù có X-gal hay không, nếu không có kháng sinh ức chế chúng vẫn phát triển thành khuẩn lạc có màu trắng và dễ nhầm lẫn với khuẩn lạc của vi khuẩ ổ hợp. Do vậy cần phải dùng kháng sinh (Kanamycin hoặc Ampicilin) để loại trừ chúng. Chúng sẽ bị kháng sinh tiêu diệt, còn vi khuẩn tiếp nhận plasmid pCR®2.1 có chứa gen sản xuất enzym phá hủy kháng sinh nên tồn tại và phát triển thành khuẩn lạc.
+ Cách tiến hành:
- Khuẩn lạc màu trắ (Luria – Bertani) được lựa
chọn nuôi cấy trong các ống chứa 5 ml môi trường LB lỏng.
- Bổ sung 5 µl Kanamycin để chọn lọc dòng có mang gen kháng kháng sinh. - Có thể bổ sung thêm X-gal vào môi trường để loại bỏ những ống môi trường có màu xanh (do đoạn gen chưa gài vào vector) mà khi chọn lọc khuẩn lạc bị lẫn tạp hoặc khi chọn lọc khuẩn lạc có nhân hơi xanh.
- Sau khi cấy khuẩn lạc, ống môi trường được lắc 200 vòng/phút trong 16 – 20 giờ ở 370C cho vi khuẩn nhân lên.
(Thành phần môi trường LB lỏng tương tự như môi trường LB agar nhưng không bổ sung agar).
* Tách DNA plasmid tái tổ hợp:
Sử dụng bộ DNA Plasmid Mini Extraction Kit của hãng BIONEER.
+ Cách tiến hành:
Bước 1: Lắc đều lọ nuôi cấy, đổ vào ống Eppendorf loại 2 ml sạch, ly tâm 10000 vòng/phút trong 2 phút để thu tế bào. Sau ly tâm bỏ dịch bên trên, giữ cặn tế bào bên dưới (dùng pipet hút hết dịch trong giữ lại cặn tế bào).
Bước 2: Thêm 250 μl dung dịch (1) vào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên xuống vài lần cho đều.
Bước 3: Thêm 250 μl dung dịch (2) vào hỗn dịch trên để phá màng tế bào, đậy nắp, nhẹ nhàng trộn bằng cách lắc xuôi ngược toàn bộ vài lần.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bước 4: Thêm 350 μl dung dịch (3), trộn nhẹ nhàng, sau đó đem ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ 40C.
Bước 5: Chuyển toàn bộ phần dịch trong bên trên lên trên màng của cột lọc. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thêm 500 μl dung dịch (D) lên trên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng 5 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới.
Bước 7: Thêm 700 μl dung dịch (4) lên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới. Ly tâm lại để làm khô cột.
Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, thêm 50 µl dung dịch (5) Elution buffer lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lọc và thu được dịch chứa DNA plasmid ở dưới.
Ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 200C.
* Kiểm tra DNA tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI:
Plasmid pCR® 3,9 enzym giớ Eco 3,9 . Eco .
Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI (Bảng 2.4)
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng cắt DNA tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI
Thành phần phản ứng Thể tích
Nước 16 μl
Buffer for EcoRI (10X) 2 μl
Enzym EcoRI 1 μl
DNA plasmid 1 μl
Tổng 20 μl
Hỗn hợp phản ứ ộn đều trong một ống Eppendorf và ủ ở 370
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
phẩm cắt cho kết quả tương ứng với kích thước DNA sản phẩm PCR, thì DNA plasmid tái tổ hợp được thu nhận và được giải trình trình tự.