trên heo con tại Đồng Tháp bằng PCR
Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phƣơng pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay kỹ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm,…. (Trần Linh Thƣớc, 2010).
PCR cũng đƣợc dùng để xác định gene kháng kháng sinh của Escherichia coli, đƣợc đánh giá là phƣơng pháp có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh và phù hợp.PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc (Trần Linh Thƣớc, 2010) :
Bước 1 (biến tính – denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA thƣờng đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao, thƣờng là 94 – 95OC. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn.
Bước 2 (bắt cặp – anealation): trong bƣớc này, nhiệt độ đƣợc hạ thấp, cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 70OC.
Bước 3 (tổng hợp – elongation): nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 72OC giúp cho DNA polymerase (vốn là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bƣớc này tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Chiết tách DNA mẫu (DNA template)
Mẫu DNA của vi khuẩn E. coli đƣợc chiết tách bằng phƣơng pháp sốc nhiệt:
Chuẩn bị: khuẩn lạc của vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng NA sau 24 giờ, nƣớc cất tinh khiết không chứa DNA, RNA.
Cách thực hiện:
Dùng pipette hút 1ml nƣớc cất cho vào ống eppendorf.
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi trƣờng NA (lấy đầy que cấy) cho vào ống eppendorf trên.
Trộn đều bằng máy vortex. Đun sôi ở 100O
C trong 10 phút. Ly tâm 15.000 vòng/15 phút.
Thu hoạch phần dịch nổi ở bên trên có chứa DNA của tế bào vi khuẩn, bảo quản ở -20OC.
Mồi dùng trong phản ứng PCR
Trình tự nucleotide các cặp mồi dùng để xác định độc tố của vi khuẩn E. coli dựa theo Maynard et al., (2003)
Bảng 3.3 : Trình tự nucleotide các cặp mồi và chu trình nhiệt phản ứng PCR xác định gene kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli (Maynard et al., 2003)
Nhóm kháng
sinh Gene
Trình tự nucleotide của mồi (5'3')
Mồi xuôi // Mồi ngƣợc
Độ dài (bp) Chu trình nhiệt Tiền biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Kéo dài (0C/phút) Kết thúc (0C/phút) (lặp lại 30 chu kỳ)
β-Lactam blaTEM
GAGTATTCAACATTTTCGT ACCAATGCTTAATCAGTGA 857 94 / 10 94 / 1 57 / 1 72 / 1 72 / 10 Aminogly- coside apk(3′)- Ia(aphA 1) ATGGGCTCGCGATAATGTC CTCACCGAGGCAGTTCCAT 600 94 / 10 94 / 1 54 / 1 72 / 1 72 / 10 Tetracyclin tetA GTGAAACCCAACATACCCC GAAGGCAAGCAGGATGTAG 888 94 / 10 94 / 1 53 / 1 72 / 1 72 / 10 Phenicol floR CGCCGTCATTCCTCACCTTC GATCACGGGCCACGCTGTGTC 215 94 / 10 94 / 1 58 / 1 72 / 1 72 / 10 Sulfonamides sulII
CGG CAT CGT CAA CAT AAC C GTG TGC GGA TGA AGT CAG
722 94 / 10 94 / 1 60 / 1 72 / 1 72 / 10
Quinolones qnrS
ACG ACA TTC GTC AAC TGC AA TAA ATT GGC ACC CTG TAG GC
Hổn hợp nhiên liệu trong phản ứng
Phản ứng PCR phát hiện gen qui định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli
đƣợc thực hiện với tổng thể 25 µl với các hóa chất do Promega (USA) sản xuất và cung cấp.
Bảng 3.4 Hỗn hợp nhiên liệu (master mix) của phản ứng PCR xác định một số gene kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên heo con (Promega Corporation, USA)
STT Thành phần Số lƣợng
1 Go Taq Greeen Master Mix 2X 12,5 µl
2 Mồi xuôi 0,5 µl
3 Mồi ngƣợc 0,5 µl
4 Nƣớc tinh khiết không chứa ADNase, ARNase 9,5 µl
5 DNA mẫu 2 µl
Tổng 25 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên máy PCR theo chu trình nhiệt ở bảng .
Phƣơng pháp điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm sau khi PCR đƣợc điện di trên thạch agarose 2%, dung môi điện di là TAE 1X buffer. Hút 5 µl sản phẩm sau khi đã chạy PCR cho vào giếng thứ hai trở đi của gel agarose, sau đó hút 5 µl 10X Blue Juice Gel Loading Buffer cho vào giếng thứ nhất của gel agarose. Sau đó đặt gel vào buồng điện di và chạy điện di ở hiệu điện thế 50v trong thời gian 1 giờ.
Nhuộm Ethidium Bromide
Sau khi kết thúc quá trình điện di, cho gel agarose vào dung dịch Ethidium Bromide, đặt lên máy lắc trong thời gian 30 phút. Rồi tiếp tục cho gel vào nƣớc cất, đặt lên máy lắc trong thời gian 10 phút.
Đọc kết quả và chụp ảnh
Sau khi nhuộm Ethidium Bromide xong, gel agarose đƣợc đƣa vào buồng đọc kết quả dƣới ánh đèn tia UV và chụp ảnh.
Kích thƣớc các đoạn gen sau khi khuếch đại đƣợc xác định dựa vào thang DNA chuẩn 1000 bp.