trên heo con
Xác định chủng kháng nguyên K bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. Các chủng khảo sát bao gồm K88, K99, 987P.
Phƣơng pháp tiến hành: trên phiến kính, nhỏ một giọt nƣớc kháng huyết thanh ở một đầu, đầu còn lại nhỏ một giọt nƣớc muối sinh lý (đối chứng). Sau đó dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên NA, hòa với hai giọt trên lắc trộn nhẹ nhàng và đọc kết quả sau 30 giây tới 15 phút.
Phản ứng dƣơng tính (+): xuất hiện những hạt ngƣng kết li ti và giọt đối chứng không ngƣng kết (trắng đục đều). Nếu cả 2 giọt đều ngƣng kết là dƣơng tính giả. Phản ứng âm tính (-): không ngƣng kết (hỗn hợp có màu trắng đục đều).
Phản ứng định danh đƣợc thể hiện qua sơ đồ
E. coli K88, K99, 987P
Sơ đồ 2. Định danh chủng vi khuẩn E. coli bằng phản ứng huyết thanh học 3.3.5 Phƣơng pháp kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn ETEC đối với một số loại kháng sinh
Kiểm tra tính nhạy cảm đối với kháng sinh của các chủng E. coli đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp dùng đĩa kháng sinh chuẩn (standardized single disk). Môi trƣờng dùng để thử tính nhạy cảm của kháng sinh là Mueller-Hinton agar.
Các bƣớc thực hiện: Kháng thể chuẩn K88, K99, 987P Phản ứng dƣơng tính (có ngƣng kết) Phản ứng âm tính (không có ngƣng Vi khuẩn E. coli Đối chứng
Chuẩn bị dung dịch McFarland 0,5
Cho vào ống nghiệm 0,05ml dung dịch BaCl2 1% và 9,95ml dung dịch H2SO4 1% lắc đều, dung dịch trong ống nghiệm sẽ có màu trắng đục.
Chuẩn bị môi trƣờng canh khuẩn:
Vi khuẩn sau khi đƣợc định danh, tiến hành ria cấy trên đĩa thạch TSA cho vào tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Tiếp theo dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa 2ml dung dịch nƣớc muối 90/00 đã vô trùng và lắc đều. Canh khuẩn đƣợc chế có độ đục tƣơng đƣơng ống McFarland 0,5 (#108 cfu/ml). Chú ý canh khuẩn chuẩn bị đƣợc sử dụng trong vòng 30 phút.
Thực hiện: Dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào ống canh khuẩn đã chuẩn bị sau đó dàn đều vi khuẩn trên mặt thạch có môi trƣờng Mueller Hinton Agar (MHA) dày khoảng 4 mm.
Chú ý khi dàn vi canh khuẩn phải cho đến khi mặt thạch khô mới dùng kẹp vô trùng đặt các đĩa kháng sinh cần kiểm tra lên trên mặt thạch, mỗi đĩa cách nhau 3 - 4 cm và cách thành đĩa petri 2 – 3 cm. Cuối cùng cho đĩa thạch đã đặt đĩa kháng sinh vào tủ ấm ở 370C trong 18 - 24 giờ.
Đọc kết quả kháng sinh đồ dựa vào đƣờng kính vòng vô khuẩn và so với bảng tiêu chuẩn Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2011)
Bảng 3.2 Tiêu chuẩn đánh giá khả năng nhạy cảm/kháng của vi khuẩn E. coli
với 7 loại kháng sinh kiểm tra (CLSI, 2011).
Tên kháng sinh Ký hiệu Hàm lƣợng kháng sinh (µg) Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Kháng (≤) Trung bình Nhạy (≥) Ceftazidime Amikacin Colistin Gentamicin Amoxicilin/clavulanic acid Norfloxacin Bactrim Cz Ak Co Ge Ax Nr Bt 30 30 10 10 10 10 25 14 14 11 12 13 12 10 15-17 15-16 12-16 13-14 14-17 13-16 11-15 18 17 17 15 18 17 16
3.3.6 Phƣơng pháp kiểm tra gene kháng kháng sinh của ETEC gây tiêu chảy trên heo con tại Đồng Tháp bằng PCR trên heo con tại Đồng Tháp bằng PCR
Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phƣơng pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay kỹ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm,…. (Trần Linh Thƣớc, 2010).
PCR cũng đƣợc dùng để xác định gene kháng kháng sinh của Escherichia coli, đƣợc đánh giá là phƣơng pháp có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh và phù hợp.PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc (Trần Linh Thƣớc, 2010) :
Bước 1 (biến tính – denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA thƣờng đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao, thƣờng là 94 – 95OC. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn.
Bước 2 (bắt cặp – anealation): trong bƣớc này, nhiệt độ đƣợc hạ thấp, cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 70OC.
Bước 3 (tổng hợp – elongation): nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 72OC giúp cho DNA polymerase (vốn là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bƣớc này tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Chiết tách DNA mẫu (DNA template)
Mẫu DNA của vi khuẩn E. coli đƣợc chiết tách bằng phƣơng pháp sốc nhiệt:
Chuẩn bị: khuẩn lạc của vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng NA sau 24 giờ, nƣớc cất tinh khiết không chứa DNA, RNA.
Cách thực hiện:
Dùng pipette hút 1ml nƣớc cất cho vào ống eppendorf.
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi trƣờng NA (lấy đầy que cấy) cho vào ống eppendorf trên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trộn đều bằng máy vortex. Đun sôi ở 100O
C trong 10 phút. Ly tâm 15.000 vòng/15 phút.
Thu hoạch phần dịch nổi ở bên trên có chứa DNA của tế bào vi khuẩn, bảo quản ở -20OC.
Mồi dùng trong phản ứng PCR
Trình tự nucleotide các cặp mồi dùng để xác định độc tố của vi khuẩn E. coli dựa theo Maynard et al., (2003)
Bảng 3.3 : Trình tự nucleotide các cặp mồi và chu trình nhiệt phản ứng PCR xác định gene kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli (Maynard et al., 2003)
Nhóm kháng
sinh Gene
Trình tự nucleotide của mồi (5'3')
Mồi xuôi // Mồi ngƣợc
Độ dài (bp) Chu trình nhiệt Tiền biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Kéo dài (0C/phút) Kết thúc (0C/phút) (lặp lại 30 chu kỳ)
β-Lactam blaTEM
GAGTATTCAACATTTTCGT ACCAATGCTTAATCAGTGA 857 94 / 10 94 / 1 57 / 1 72 / 1 72 / 10 Aminogly- coside apk(3′)- Ia(aphA 1) ATGGGCTCGCGATAATGTC CTCACCGAGGCAGTTCCAT 600 94 / 10 94 / 1 54 / 1 72 / 1 72 / 10 Tetracyclin tetA GTGAAACCCAACATACCCC GAAGGCAAGCAGGATGTAG 888 94 / 10 94 / 1 53 / 1 72 / 1 72 / 10 Phenicol floR CGCCGTCATTCCTCACCTTC GATCACGGGCCACGCTGTGTC 215 94 / 10 94 / 1 58 / 1 72 / 1 72 / 10 Sulfonamides sulII
CGG CAT CGT CAA CAT AAC C GTG TGC GGA TGA AGT CAG
722 94 / 10 94 / 1 60 / 1 72 / 1 72 / 10
Quinolones qnrS
ACG ACA TTC GTC AAC TGC AA TAA ATT GGC ACC CTG TAG GC
Hổn hợp nhiên liệu trong phản ứng
Phản ứng PCR phát hiện gen qui định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli
đƣợc thực hiện với tổng thể 25 µl với các hóa chất do Promega (USA) sản xuất và cung cấp.
Bảng 3.4 Hỗn hợp nhiên liệu (master mix) của phản ứng PCR xác định một số gene kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên heo con (Promega Corporation, USA)
STT Thành phần Số lƣợng
1 Go Taq Greeen Master Mix 2X 12,5 µl
2 Mồi xuôi 0,5 µl
3 Mồi ngƣợc 0,5 µl
4 Nƣớc tinh khiết không chứa ADNase, ARNase 9,5 µl
5 DNA mẫu 2 µl
Tổng 25 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên máy PCR theo chu trình nhiệt ở bảng . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phƣơng pháp điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm sau khi PCR đƣợc điện di trên thạch agarose 2%, dung môi điện di là TAE 1X buffer. Hút 5 µl sản phẩm sau khi đã chạy PCR cho vào giếng thứ hai trở đi của gel agarose, sau đó hút 5 µl 10X Blue Juice Gel Loading Buffer cho vào giếng thứ nhất của gel agarose. Sau đó đặt gel vào buồng điện di và chạy điện di ở hiệu điện thế 50v trong thời gian 1 giờ.
Nhuộm Ethidium Bromide
Sau khi kết thúc quá trình điện di, cho gel agarose vào dung dịch Ethidium Bromide, đặt lên máy lắc trong thời gian 30 phút. Rồi tiếp tục cho gel vào nƣớc cất, đặt lên máy lắc trong thời gian 10 phút.
Đọc kết quả và chụp ảnh
Sau khi nhuộm Ethidium Bromide xong, gel agarose đƣợc đƣa vào buồng đọc kết quả dƣới ánh đèn tia UV và chụp ảnh.
Kích thƣớc các đoạn gen sau khi khuếch đại đƣợc xác định dựa vào thang DNA chuẩn 1000 bp.
3.3.7 Các chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con tại tỉnh Đồng Tháp. Tỷ lệ heo con bệnh tiêu chảy do E. coli ở tỉnh Đồng Tháp.
Kết quả phân bố các chủng E. coli K88, K99, 987P trên heo con theo mẹ và sau cai sữa.
Tính nhạy cảm của vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc với một số loại kháng sinh Sự hiện diện của gene kháng kháng sinh của các chủng ETEC trên heo con tiêu chảy
3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý thống kê theo phƣơng pháp Chi-square bởi phần mềm Minitab 16.0, Chi square Yates và Fixer Exactly Test bởi phần mềm Excel 2003.
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Khảo sát điều kiện tự nhiên và tình hình chăn nuôi tại huyện Châu Thành và huyện Lấp Vò tỉnh Đồng Tháp và huyện Lấp Vò tỉnh Đồng Tháp
(www.dongthap.gov.vn)
Vị trí địa lí
Đồng Tháp là một trong 13 tỉnh của vùng đồng bằng sông Cửu Long, nằm ở đầu nguồn sông Tiền,. Phía Bắc giáp với tỉnh Long An, phía tây bắc giáp tỉnh Preyveng thuộc Campuchia, phía nam giáp An Giang và Cần Thơ. (http://www.dongthap.gov.vn). Gồm 12 huyện, thị xã, thành phố: 01 thành phố: Cao Lãnh (Tỉnh l )., 02 thị xã: Sa Đéc, Hồng Ngự và 9 huyện: Tân Hồng, Hồng Ngự, Tam Nông, Thanh Bình, Tháp Mƣời, Cao Lãnh, Lấp Vò, Lai Vung, Châu Thành.
Khí hậu: Nhiệt đới gió mùa. Nhiệt độ trung bình 27,190C. Độ ẩm: 83%. Lƣợng mƣa 1.170-.1520 mm.
Hệ thống sông ngòi: Hai nhánh sông chính Sông Tiền và Sông Hậu,quanh năm bồi đắp phù sa, thuận lợi: nuôi trồng thủy sản, giao thông đƣờng thủy, du lịch sinh thái.
Tình hình chăn nuôi
Theo số liệu thống kê đến tháng 10/2013 tỉnh Đồng Tháp có tổng số 252.623 con heo, trong đó có 226.710 con heo thịt, 25.559 con heo nái, 354 con heo đực giống (channuoivietnam.com).
Qua quá trình khảo sát, ghi nhận và lấy mẫu tại huyện Châu Thành và Lấp Vò, các nông hộ heo đƣợc nuôi bằng thức ăn hỗn hợp, tự chế biến và thức ăn tận dụng từ phụ phẩm bột gạo, đây là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy cho heo con. Chuồng nuôi heo đa số là kiểu chuồng hở, máng ăn thiết kế nằm trong chuồng, có vòi uống cho heo, nền chuồng làm bằng xi măng và đƣợc vệ sinh bằng nƣớc hằng ngày. Thức ăn thừa chƣa đƣợc quan tâm vệ sinh, đây là nguyên nhân để các loại vi khuẩn có hại phát triển. Công tác vệ sinh sát trùng chƣa đƣợc chú trọng, các nông hộ chỉ sát trùng thƣờng xuyên khi có dịch bệnh xảy ra. Ngoài ra, chuồng nuôi chƣa đƣợc cách ly tốt, các vật nuôi nhƣ chó, gà, vịt có thể vào chuồng nuôi tìm thức ăn thừa tự do, đây chính là nguy cơ phát tán mầm bệnh trong chuồng.
Do vậy tình hình dịch bệnh tiêu chảy trên heo con tại đây cần đƣợc quan tâm hơn.
4.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con tại các huyện tại tỉnh Đổng Tháp Đổng Tháp
Qua thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã tiến hành khảo sát 118 con heo tiêu chảy trong tổng số 735 heo con tại các hộ chăn nuôi thuộc huyện Châu Thành, và huyện Lấp Vò. Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con đƣợc trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.2: Tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con tại huyện Châu Thành và Lấp Vò
Địa điểm Số mẫu khảo sát
Số mẫu heo tiêu chảy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
SL (con) Tỷ lệ (%) Châu Thành 410 91 22,20 Lấp Vò 325 97 29,85 (P=0,018) Tổng cộng 735 118 25,58 SL: số lượng
Trong 735 heo con khảo sát,có 118 tiêu chảy (25,58%) trong đó huyện Lấp Vò chiếm tỷ lệ cao nhất 29,85%, kế đến là huyện Châu Thành (22,20%) (P=0,018). Kết
quả này có thể đƣợc giải thích do mẫu đƣợc lấy tại 2 huyện vào cùng thời điểm là vào mùa mƣa nên môi trƣờng ngoại cảnh là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sức đề kháng của gia súc, điều này có thể làm cho heo con rất dễ cảm nhiễm với bệnh tiêu chảy. Thêm vào đó, mẫu phân heo tiêu chảy chủ yếu đƣợc thu thập tại nông hộ nên cách chăm sóc nuôi dƣỡng chƣa đƣợc đảm bảo, ủ ấm không tốt nên heo con dễ bị lạnh, dẫn đến suy giảm sức đề kháng, ảnh hƣởng đến khả năng tiêu hóa thức ăn của heo con, vì vậy những vi sinh vật trong đƣờng ruột có cơ hội để phát triển nhất là vi khuẩn E. coli. (Đào Trọng Đạt và ctv, 1999).
Theo Hồ Văn Nam và ctv. (1997), khi gia súc bị nhiễm lạnh kéo dài sẽ làm giảm phản ứng miễn dịch, giảm tác dụng thực bào, làm cho gia súc dễ bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh. Theo tập quán của nhà chăn nuôi hay tận dụng nƣớc mƣa, nƣớc sông làm nguồn cung cấp nƣớc uống cho heo, nhƣng việc đảm bảo chƣa đƣợc tốt nên đã tạo điều kiện cho vi sinh vật có hại phát triển dẫn đến rối loạn tiêu hóa kèm theo viêm ruột, tiêu chảy ở gia súc, thêm vào đó sự thay đổi về các điều kiện ngoại cảnh, thức ăn cũng dẫn đến tiêu chảy ở heo con.
Kết quả của chúng tôi thấp hơn so với nghiên cứu của Trần Thị Mỹ Nhân (2012), khảo sát ở Cần Thơ và Vĩnh Long với tỷ lệ tiêu chảy ở heo con lần lƣợt là 27,29% và 29,62%.
4.3 Tình hình bệnh tiêu chảy trên heo con theo mẹ và sau cai sữa
Qua khảo sát 382 heo con theo mẹ và 353 heo con cai sữa, số heo con theo mẹ tiêu chảy là 100, heo con cai sữa tiêu chảy là 88. Kết quả khảo sát tỷ lệ tiêu chảy trên heo con theo mẹ và sau cai sữa đƣợc trình bày trong bảng 4.2
Bảng 4.3: Tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con theo mẹ và sau cai sữa
Lứa tuổi Số heo con
khảo sát Số heo con tiêu chảy Tỷ lệ (%) Theo mẹ Cai sữa 382 353 100 88 26,2 24,9 (P>0,05) Tổng 735 188 25,6
Từ Bảng 4.2 cho thấy tỷ lệ tiêu chảy ở heo con theo mẹ là 26,2% và ở heo sau cai sữa là 24,9%, tỷ lệ này khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P=0,698). Theo Hampson (2001), ở các giai đoạn sinh trƣởng và phát triển, heo các lứa tuổi khác nhau có những đặc điểm giải phẫu, sinh lý khác nhau, sự đáp ứng của cơ thể với các
yếu tố stress, tác nhân gây bệnh khác nhau. Mặc khác, đây là giai đoạn heo bắt đầu cai sữa và thức ăn bổ sung từ bên ngoài là nguồn dinh dƣỡng chính. Điều này phù hợp tình hình thực tế trong chăn nuôi ngƣời chăn nuôi hay tận dụng các thức sẳn có trong gia đình cung cấp vƣợt quá so với nhu cầu dinh dƣỡng cơ thể, sự thay đổi thành phần thức ăn có thể dẫn đến những biến đổi bệnh lý và thành phần hóa-sinh trong ruột non, tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập và gây bệnh. Thêm vào đó tiêu hóa chƣa có men pepsin, khả năng tiết dịch vị chậm nên dễ bị nhiễm khuẩn qua đƣờng tiêu hóa (Đào Trọng Đạt, 1996). Hệ miễn dịch chƣa hoàn thiện, lúc mới đẻ ra hầu nhƣ trong huyết thanh heo không có kháng thể, lƣợng kháng thể đƣợc tăng nhanh khi heo con bú sữa đầu, nên khả năng miễn dịch của heo con là thụ động, phụ thuộc vào lƣợng kháng thể từ mẹ qua sữa đầu.
Đối với heo con theo mẹ, tỷ lệ tiêu chảy (24,9%) điều này có thể đƣợc giải thích rằng heo con từ sơ sinh đến 7 ngày tuổi là giai đoạn heo chịu áp lực lớn nhất về thay đổi điều kiện sống chủ yếu là điều kiện nhiệt độ chuồng nuôi. Heo con đƣợc tập ăn rất sớm 5 đến 7 ngày đây cũng là một trong những lí do dẫn đến tiêu chảy trên heo con theo mẹ gì khi heo bắt đầu tập ăn, vi khuẩn có thể dễ dàng xâm nhập vào cơ thể