Theo J. Acar & B. Röstel (2001), sự đề kháng với một loại kháng sinh có thể là do sự thích ứng tự nhiên của vi khuẩn hoặc một cơ chế khác. Vi khuẩn sống sót sau khi chịu ảnh hƣởng của thuốc kháng sinh là một phản ứng bình thƣờng của một tế bào vi khuẩn. Khi thành công, quá trình phản ứng đó trở thành nguồn gốc để một bản sao của tế bào vi khuẩn có khả năng đối mặt với kháng sinh.Tuy nhiên, theo các cơ chế kháng, các bản sao vi khuẩn có thể đối đầu với các lƣợng kháng sinh khác nhau, từ một lƣợng nhỏ, rồi gần với nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng trƣởng (MIC) của tế bào vi khuẩn, rồi đến một số lƣợng rất lớn các loại thuốc kháng sinh (ví dụ nhƣ exoenzyme enzyme thủy phân sản xuất bởi các vi khuẩn ). Nó là một thực tế rất phổ biến rằng vi khuẩn có thể chống lại bất kỳ loại kháng sinh nào, và đây là một hiện tƣợng toàn cầu có ảnh hƣởng đến tất cả các quốc gia. Tuy nhiên, đặc điểm của hiện tƣợng kháng kháng sinh có liên quan đến các loài vi khuẩn bị ảnh hƣởng, tập hợp các thuốc kháng sinh, sự phân bố của các chủng kháng thuốc trong các lĩnh vực kháng sinh đƣợc sử dụng (bệnh viện, cộng đồng, chăn nuôi, vv.) Các chủng kháng thuốc đƣợc phân loại theo xác định của họ ( chi , loài) và kháng kháng sinh kiểu hình của chúng ( đôi khi đƣợc gọi là antibiotype hoặc kiểu mẫu kháng kháng sinh).
Điều quan trọng cần lƣu ý rằng một tế bào vi khuẩn thƣờng sở hữu nhiều hơn một cơ chế để chống lại một kháng sinh. Sự kết hợp giữa một số cơ chế kháng thƣờng tạo ra sức đề kháng cao cho vi khuẩn với kháng sinh.
Có hai cơ chế di truyền điều khiển các protein liên quan đến sự đề kháng là: + Đột biến ở một gene hiện có (nhiễm sắc thể, plasmid)
+ Tiếp nhận gene chi phối sự đề kháng. Vị trí tiếp nhận hoặc các gene mới tiếp nhận rất quan trọng (nhiễm sắc thể, integrons, transposon hoặc plasmid).
Vai trò quan trọng nhất của vị trí gene kháng thuốc là liên quan đến sự lây lan sự đề kháng. Nếu đột biến ở nhiễm săc thể, bản sao từ tế bào này sẽ nhân lên và lây lan, kiểu lây truyền này đƣợc gọi là là lan truyền dọc. Nếu một gen kháng nằm trên một
transposon hoặc plasmid có thể đƣợc truyền theo chiều ngang, độc lập với sự lây lan của bản sao vi khuẩn chứa gene kháng.
Hơn nữa, việc truyền ngang có thể xảy ra giữa các loài vi khuẩn khác nhau, đồng thời hoặc độc lập để mở rộng khả năng kháng thuốc của vi khuẩn, lây truyền qua plasmid sẽ diễn ra một cách mạnh mẽ, có tới sáu đến tám loài vi khuẩn Gram âm đƣợc báo cáo có lây truyền theo cách nay. Plasmid hoặc transposon là các hệ thống chính (vật liệu di truyền) chuyển từ vi khuẩn kháng (cung cấp) với vi khuẩn (nhận). Chúng thƣờng mang theo nhiều hơn một gene của sự đề kháng. Plasmid lớn có thể chuyển các gene có các cơ chế kháng khác nhau giúp vi khuẩn chống lại nhiều loại kháng sinh khác nhau, và sự xuất hiện đồng thời các cơ chế này trên cùng một vi khuẩn giúp tạo nên hiện tƣợng đa kháng thuốc.
Vi khuẩn phát triển nhiều cơ chế đề kháng để tạo nên đề kháng kháng sinh. Sự đề kháng này đã đƣợc nghiên cứu và ghi nhận với các cơ chế chủ yếu sau: sản xuất enzyme làm bất hoạt kháng sinh; thay đổi điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào vi khuẩn; đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng, làm giảm nồng độ kháng sinh trong tế bào vi khuẩn khuẩn.
Hình 2.1: Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn (http://asig.org.au/mechanisms-and-genomics-of-resistance/)
Các nhóm kháng sinh bị kháng phổ biến:
Kháng sinh thuộc nhóm β-Lactam có khả năng diệt khuẩn là nhờ vòng β- lactam kết hợp bền vững với transpeptidase - enzym tham gia tổng hợp peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn. Do đó, ức chế quá trình tạo thành tế bào, làm ly giải hoặc biến dạng vi khuẩn. Vi khuẩn gram âm có thể đề kháng lại các kháng sinh này là do vi khuẩn tự sản sinh ra enzym β-lactamase. Enzym này sẽ thủy phân vòng β-lactam và làm mất hoạt tính diệt khuẩn của kháng sinh. Có rất nhiều loại enzym β-lactamase đã đƣợc xác định nhƣ TEM-, SHV-, OXA-, CMY-, CTX-Mb, AmpC-. Tuy nhiên, các β-lactamase đƣợc mã hóa bởi các gen blaTEM là phổ biến nhất ở vi khuẩn gram âm (Ahmed et al, 2007) và những chủng vi khuẩn sản sinh β-lactamase – TEM sẽ có khả năng đề kháng với các kháng sinh thuộc nhóm Penicillin và Cephalosporin thế hệ thứ nhất.
Đối với nhóm Aminoglycoside, theo Maynard et al (2003), gene aph(3„)- Ia(aphA1) mã hóa cho kiểu hình đề kháng Kanamycin và Neomycin. Kết quả bảng 4.9 cho ta thấy tỷ lệ gene aph(3„)-Ia(aplA1) là 23,08% với 3/13 chủng dƣơng tính. Đối với nhóm Tetracylin, Tetracyclin là nhóm kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn do kháng sinh có thể gắn lên các ribosome. Kháng sinh này đƣợc sử dụng rộng rãi điều trị bệnh vật nuôi và bổ sung vào thức ăn chăn nuôi từ rất lâu. Tuy nhiên, một trong những vấn đề lớn khi sử dụng kháng sinh này là hiện tƣợng vi khuẩn kháng thuốc. Vi khuẩn có khả năng đề kháng lại Tetracyclin là nhờ một trong ba cơ chế: (1) vi khuẩn sẽ sản sinh ra một protein trong tế bào chất, protein này có chức năng bơm Tetracyclin từ bên trong tế bào ra bên ngoài và luôn duy trì nồng độ Tetracyclin ở mức rất thấp, không đủ ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào; (2) vi khuẩn sản sinh ra protein có trọng lƣợng phân tử khoảng 72 kDa, protein này bám lên ribosome và ngăn cản quá trình tƣơng tác của Tetracyclin lên ribosome; (3) vi khuẩn sản sinh ra enzyme (44 kDa) làm biến đổi cấu trúc hóa học của Tetracyclin, do đó làm kháng sinh mất hoạt tính diệt khuẩn và đƣợc thẩm thấu chủ động qua màng tế bào ra bên ngoài. Các protein tham gia vào quá trình đề kháng với Tetracyclin của vi khuẩn đƣợc mã hóa bởi các gen kháng kháng sinh. Có hơn 60 gen kháng Tetracyclin (tet) đã đƣợc xác định và giải trình tự nucleotide. Tuy nhiên, ba trong số những gen thƣờng gặp nhất là tetA, tetB và tetC.
Kháng sinh họ Phenicol (Chloramphenicol, Florfenicol) gắn vào tiểu đơn vị 50S, ức chế enzym peptidyl transferase, do đó ức chế quá trình sinh tổng hợp protein của vi khuẩn. Đây cũng là những kháng sinh đƣợc sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi. Hiện nay, Chloramphenicol đã đƣợc cấm sử dụng trong điều trị bệnh gia súc cũng nhƣ bổ sung vào thức ăn. Florfenicol là kháng sinh thế hệ mới, có nguồn
gốc từ Chloramphenicol với nhóm p-methyl sulfonyl, fluorine thay thế cho nhóm p-nitro và hydroxyl trong cấu trúc của Chloramphenicol. Gen floR đƣợc xem là gen giúp vi khuẩn đề kháng lại với Chloramphenicol và Florfenicol. Gen floR mã hóa cho protein màng, protein này hoạt động nhƣ cái bơm để đẩy Chloramphenicol và Florfenicol từ bên trong tế bào vi khuẩn ra ngoài. Vì thế, không đủ lƣợng kháng sinh cần thiết để thể hiện hoạt tính đối với vi khuẩn (Ahmed và cs., 2009)
Đối với nhóm Sulfonamides, Khả năng đề kháng với kháng sinh nhóm Sulfonamide của vi khuẩn E. coli là rất phổ biến. Quá trình này có đƣợc là nhờ 3 gen là sulI, sulII và sulIII, mã hóa cho enzym dihydropteroate synthase - ức chế hoạt tính của Sulfonamide (Enne và cs., 2001)
Đối với nhóm Quilonones, Cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh nhóm Quinolone đƣợc Martınez-Martınez và cs. phát hiện vào năm 1998. Gen điều hòa quá trình này là qnr nằm trên plasmid có khả năng truyền ngang. Có 3 gen qnr
đã đƣợc xác định là qnrA, qnrB và qnrS. Những gen này mã hóa cho protein của nhóm pentapeptide để vô hoạt hoạt tính diệt khuẩn của kháng sinh (Robicsek và
cs., 2006). Bên cạnh đấy, một cơ chế mới liên quan đến gen aac(6')-Ib-cr cũng đƣợc phát hiện. Gen aac(6')-Ib-cr mã hóa cho biến thể mới của enzyme aminoglycoside acetyltransferase với 2 thay đổi tại vị trí axit amin 102 và 179. Enzyme này có tác dụng làm giảm hoạt tính của kháng sinh (Robicsek và cs., 2006)
CHƢƠNG 3
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 2014
Địa điểm lấy mẫu:
Các trại heo và nông hộ tại huyện Châu Thành và huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp.
Địa điểm nuôi cấy – phân lập:
Phòng thí nghiệm vệ sinh thực phẩm E208, Bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng - Trƣờng Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Đối tƣợng
Phân heo con tiêu chảy ở lứa tuổi theo mẹ và sau cai sữa từ tỉnh Đồng Tháp. Tất cả những mẫu phân này đƣợc lấy khi heo chƣa đƣợc điều trị kháng sinh và có pH ≥ 7.
3.2 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm
Tủ sấy, tủ ấm, autoclave, máy ly tâm, máy lắc, máy chạy điện di, máy PCR, bếp đun cách thuỷ, buồng cấy vô trùng, cân, kính hiển vi, dao, kéo, đĩa petri, , ống đong, ống hút, chai, que cấy, đèn cồn, nhiệt kế, túi nylon, kính hiển vi, ống nhỏ giọt và một số dụng cụ khác.
3.2.2 Hoá chất, môi trƣờng
Cồn, nƣớc cất, sodium chloride, calcium chloride, potassium chloride, MacConkey Agar (MC), Trypticase Soy Agar (TSA; BBL, USA), Nutrient Agar (NA),MHA (Muller Hinton Agar).
Kháng thể chuẩn K88, K99, 987P đƣợc sử dụng từ phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Thú Y – Trƣờng Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo, Nhật Bản (đƣợc cung cấp bởi Denka Seiken Co., Ltd. Tokyo Japan).
Đĩa giấy tẩm kháng sinh do công ty Nam Khoa sản xuất.
Các hóa chất và dung dịch dùng cho phản ứng PCR: ethanol, TE buffer, TAE buffer, agarose, Nuclease-free water, Go Tab Green Master Mix 2X (Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wi 53711-5399, USA, Lot No: 0000037120.
3.3 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm 3.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 3.3.1 Chẩn đoán lâm sàng
Heo sơ sinh có thể tiêu chảy sau khi bệnh 2-3 giờ và trong những ngày đầu heo con tiêu chảy mạnh, có thể toàn nƣớc. Màu sắc phân thay đổi từ không màu đến ánh trắng và nâu đất đôi khi có bọt hoặc không. Tiêu chảy trên heo sau cai sữa thì tƣơng tự heo sơ sinh nhƣng ít trầm trọng hơn cụ thể là tỷ lệ chết ít hơn. Đôi khi quan sát thấy màu phân vàng đến nâu. Đây là chỉ tiêu khá quan trọng trong chẩn đoán vì chúng ta có thể dựa vào màu phân để phân biệt bệnh tiêu chảy do E. coli so với các nguyên nhân khác.
pH: Có thể chẩn đoán phân biệt dựa vào pH phân. Dịch tiêu chảy do ETEC gây ra thƣờng có pH kiềm, trong khi đó nếu bệnh tiêu chảy do hấp thu kém hay do virus gây ra thì phân có pH acid.
3.3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu
Dùng bông có tẩm cồn 700 sát trùng quanh vùng hậu môn sau đó dùng que tâm bông vô trùng cho vào sâu vào niêm mạc trực tràng xoay tăm bông để tăm bông thấm ƣớt phân heo, lấy ra cho vào ống nghiệm vô trùng chứa môi trƣờng chuyên chở (Cary Blair) ghi nhãn, bảo quản trong điều kiện 4 – 80C và chuyển về phòng thí nghiệm (dùng lửa hơ phần que tăm bông còn lại trƣớc khi cho vào ống nghiệm). Cách ghi nhãn: ngày lấy mẫu, code mẫu.
3.3.3 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn E. coli và định danh các chủng K88, K99, 987P gây tiêu chảy trên heo con tại tỉnh Đồng Tháp K99, 987P gây tiêu chảy trên heo con tại tỉnh Đồng Tháp
Sơ đồ 1: Qui trình nuôi cấy và phân lập, định danh vi khuẩn ETEC
Mẫu phân
MC
370C/24 giờ
Cấy thuần trên MC
370C/24 giờ
NA
370C/24 giờ
Thử các chỉ tiêu sinh hóa
370C/24 giờ E. coli NA 370C/24 giờ Định chủng K99 K88 987P
ETEC tiêu chảy trên heo con
TSA
Giữ giống Kháng sinh đồ MHA
Đặc tính sinh hóa
Bảng 3.1 Phản ứng sinh hóa xác định E. coli
Vi khuẩn KIA
Indole MR VP Citrate Glucose Lactose H2S Gas
E. coli + + - + + + - -
Enterobacter + + - + - - + +
Citrobacter + + - + - + - +
Klebsiella +h +h - + - - + +
VP: Voges-Prokauer KIA: Kligler Iron Agar MR: Methyl Red (+): dương tính (-) âm tính
Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi glucose, galactose, mantose, arabinose, xylose, malnitol, fructose. Có thể lên men hoặc không lên men các đƣờng Sacchacrose, rafinose, xalixin, esculin, dunxit, glycerol.
Vi khuẩn E. coli không lên men các đƣờng dextrin, amindon, glycogen, inosit. Vi khuẩn E. coli đƣợc định danh bằng phản ứng sinh hóa qua các môi trƣờng: TSI: là môi trƣờng Triple Iron Sugar Agar lấy vi khuẩn từ môi trƣờng NA cấy vào ống nghiệm chứa thạch nghiêng KIA, ủ ở 370C trong 24 giờ.
Kết quả: E. coli lên men đƣờng lactose, đƣờng glucose và có sinh hơi.
Phản ứng kiểm tra tính sinh Indole: dùng que cấy, cấy một lƣợng nhỏ sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA vào ống nghiệm chứa môi trƣờng peptone, ủ ấm ở 370
C trong 24 giờ. Nhỏ vào môi trƣờng nuôi cấy vài giọt thuốc thử Kowacs. Kết quả là
E. coli cho phản ứng dƣơng tính, trên bề mặt môi trƣờng xuất hiện 1 lớp màu đỏ. Phản ứng Methyl Red (MR) và Proskauer (VP): dùng que cấy, cấy một lƣợng nhỏ sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng NA vào ống nghiệm chứa môi trƣờng MR-VP ủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Thêm vài giọt thuốc thử Methyl Red, E. coli cho phản ứng MR dƣơng tính, môi trƣờng có vòng màu đỏ. Với phản ứng VP, nhỏ vào môi trƣờng nuôi cấy vài giọt thuốc thử VP1, sau đó nhỏ vào vài giọt VP2 để yên vài phút. E. coli cho phản ứng âm tính, bề mặt môi trƣờng không màu.
Phản ứng Citrate: lấy vi khuẩn từ môi trƣờng TSA cấy vào ống nghiệm chứa thạch nghiêng Simmon‟s Citrate, giữ 370C trong 24 giờ. E. coli cho phản ứng âm tính, môi trƣờng không đổi màu.
3.3.4 Phƣơng pháp định danh các chủng E. coli K88, K99, 987P gây tiêu chảy trên heo con trên heo con
Xác định chủng kháng nguyên K bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. Các chủng khảo sát bao gồm K88, K99, 987P.
Phƣơng pháp tiến hành: trên phiến kính, nhỏ một giọt nƣớc kháng huyết thanh ở một đầu, đầu còn lại nhỏ một giọt nƣớc muối sinh lý (đối chứng). Sau đó dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên NA, hòa với hai giọt trên lắc trộn nhẹ nhàng và đọc kết quả sau 30 giây tới 15 phút.
Phản ứng dƣơng tính (+): xuất hiện những hạt ngƣng kết li ti và giọt đối chứng không ngƣng kết (trắng đục đều). Nếu cả 2 giọt đều ngƣng kết là dƣơng tính giả. Phản ứng âm tính (-): không ngƣng kết (hỗn hợp có màu trắng đục đều).
Phản ứng định danh đƣợc thể hiện qua sơ đồ
E. coli K88, K99, 987P
Sơ đồ 2. Định danh chủng vi khuẩn E. coli bằng phản ứng huyết thanh học 3.3.5 Phƣơng pháp kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn ETEC đối với một số loại kháng sinh
Kiểm tra tính nhạy cảm đối với kháng sinh của các chủng E. coli đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp dùng đĩa kháng sinh chuẩn (standardized single disk). Môi trƣờng dùng để thử tính nhạy cảm của kháng sinh là Mueller-Hinton agar.
Các bƣớc thực hiện: Kháng thể chuẩn K88, K99, 987P Phản ứng dƣơng tính (có ngƣng kết) Phản ứng âm tính (không có ngƣng Vi khuẩn E. coli Đối chứng
Chuẩn bị dung dịch McFarland 0,5
Cho vào ống nghiệm 0,05ml dung dịch BaCl2 1% và 9,95ml dung dịch H2SO4 1% lắc đều, dung dịch trong ống nghiệm sẽ có màu trắng đục.
Chuẩn bị môi trƣờng canh khuẩn:
Vi khuẩn sau khi đƣợc định danh, tiến hành ria cấy trên đĩa thạch TSA cho vào tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Tiếp theo dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa 2ml dung dịch nƣớc muối 90/00 đã vô trùng và lắc đều. Canh khuẩn đƣợc chế có độ đục tƣơng đƣơng ống McFarland 0,5 (#108 cfu/ml). Chú ý canh khuẩn chuẩn bị đƣợc sử dụng trong vòng 30 phút.
Thực hiện: Dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào ống canh khuẩn đã chuẩn bị sau đó dàn đều vi khuẩn trên mặt thạch có môi trƣờng Mueller Hinton Agar (MHA) dày khoảng 4 mm.
Chú ý khi dàn vi canh khuẩn phải cho đến khi mặt thạch khô mới dùng kẹp vô trùng đặt các đĩa kháng sinh cần kiểm tra lên trên mặt thạch, mỗi đĩa cách nhau 3 -