Một tính chất quan trọng của tinh bột là quá trình thủy phân liên kết giữa các đơn vị glucose bằng acid hoặc bằng enzyme. Acid có thể thủy phân tinh bột ở dạng hạt ban đầu hoặc ở dạng hồ hóa, enzyme chỉ thủy phân tinh bột ở dạng hồ hóa. Một số enzyme thường được sử dụng để thủy phân tinh bột là - amylase, - amylase. Khi thủy phân tinh bột acid và enzyme đều thủy phân liên kết - 1,4 - glycozide. Phản ứng thủy phân làm giảm nhanh độ nhớt của tinh bột và tạo ra đường.
Sự thủy phân tinh bột bằng acid a. Cơ chế thủy phân tinh bột bằng acid
Phản ứng thủy phân tinh bột có thể biểu diễn bằng phương trình phản ứng (C6H10O5)n + (n - 1) H2O n C6H12O6
Phản ứng thủy phân trong dung dịch nước có tốc độ rất bé ngay cả khi ở nhiệt độ cao. Tốc độ của phản ứng sẽ tăng nhanh khi thêm một lượng nhỏ ion hidro, tạo sản phẩm là glucose.
Hình 13. Sơ đồ thủy phân tinh bột
b. Các yếu tố ảnh hưởng
Ảnh hưởng của acid:
Tốc độ thủy phân giảm dần từ HI > HClO4 > HBr > HCl > HNO3 > H2SO4 > HCOOH.
Ảnh hưởng của tinh bột đến nồng độ acid:
Hoạt độ của acid trong hỗn hợp thủy phân có chứa tinh bột thường không tỷ lệ với lượng acid thêm vào mà thường nhỏ hơn. Như vậy có thể chứng tỏ rằng tinh bột và các tạp chất liên kết với tinh bột như lipid, SiO2, photphat, muối kim loại Ca, Mg, K, Na,... đã ảnh hưởng đến hoạt độ của acid.
Oxy hóa và trùng hợp
Thủy phân Đảo chiều
acid levulic + acid formic Acid humic
Thủy phân
Thủy phân A
Các liên kết glycozide có độ bền khác nhau đối với acid. Tính chất này không những do bản chất của của các gốc monosaccharide tạo thành mà còn do cấu trúc không gian chung của polysaccharide quyết định.
c. Các sản phẩm của phản ứng thủy phân tinh bột bằng acid
Tinh bột Oligosaccharide Glucose Gentiobioza
Hình 14. Sơ đồ sản phẩm phản ứng thủy phân tinh bột
Trong thực tế phản ứng xảy ra theo hướng A rất nhỏ chỉ khoảng 1%. Sự tạo thành oligosaccharide và monosacharide
Sự thủy phân bao gồm sự phân cắt từng phần các liên kết glycozide. Do đó bên cạnh monosaccharide còn tạo thành các mảnh oligosaccharide.
Tùy theo mức độ thủy phân mà các oligosaccharide được tạo thành với hiệu suất cực đại khác nhau (Bảng 4).
Bảng 4. Hiệu suất cực đại của oligosaccharide với mức độ thủy phân tinh bột khác nhau
(Nguồn: Bùi Đức Hợi, 2007)
Sản phẩm phân ly
Hiệu suất cực đại (%) khi
Hiệu suất cực đại (%) Mức độ thủy phân khi hiệu suất cực đại (%) Mức độ thủy phân 25% Mức độ thủy phân 50% Mức độ thủy phân 75% Monosaccharide 6,3 25 56 100 100 Disaccharide 9,4 25 28,1 29,8 66,7 Trisaccharide 10,5 18,8 10,5 18,8 50 Tetrasaccharide 10,5 12,5 3,2 13,8 40 Khử nước Hydroxymetilfucfurol
Như vậy muốn có hiệu suất cực đại của oligosaccharide khi thủy phân disaccharide cần phải ngừng phản ứng sau khi 2/3 liên kết glycozide đã bị phân cắt. Đối với trisaccharide thì ngừng phản ứng khi một nửa số liên kết glycozide đã bị phân cắt. Sự thủy phân monosaccharide trong môi trường acid
Trong quá trình thủy phân, các monosaccharide tạo thành dưới tác dụng của nhiệt
độ và acid sẽ bị dehydrat hóa và tạo thành dung dịch có màu sẫm. Sau này khi bảo
quản từ dung dịch thoát ra những kết tủa acid.
Sự thủy phân tinh bột dưới xúc tác enzyme
a. Đặc tính và cơ chế tác dụng của hệ enzyme amylase
- amylase
Hình 15. Enzyme - amylase
Đặc tính enzyme - amylase
- amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi - amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng.
- amylase là một protein giàu tyrosine, trytophan, acid glutamic và aspartic. Các acid glutamic và acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme, - amylase có ít methionine và có 7 – 10 gốc cysteine.
Dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng.
Mỗi phân tử - amylase đều có chứa nguyên tử Ca. Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965). Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến hình và tác động của enzyme phân giải protein. Nếu phân tử - amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất,
- amylase bền với nhiệt hơn các amylase khác.
Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu2+, Ag+,.. Điều kiện hoạt động của - amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. Ví dụ: pH tối thích cho hoạt động của - amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm là 5,3 (hoạt động tốt trong khoảng 4,7 – 5,4), độ bền với acid của - amylase malt kém hơn so với - amylase nấm mốc.
Độ bền của - amylase bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH. Tuy nhiên so với các loại amylase khác thì độ bền nhiệt của - amylase cao hơn, thường chịu được đến nhiệt độ 700C. Ở 00C và pH = 3,6 thì - amylase của malt hoàn toàn bị mất hoạt tính, - amylase của mầm thóc và malt hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 58 - 600C.
- amylase có khả năng phân cắt các liên kết - 1,4 - glycozide của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là enzyme nội bào.
Cơ chế tác dụng của - amylase
Hình 16. Sơ đồ tác dụng của của hệ enzyme amylase lên tinh bột
Sự thủy phân tinh bột của - amylase trải qua nhiều giai đoạn:
Trước tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này bị thủy phân tiếp tục để tạo ra maltose và glucose.
Amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide hay còn gọi là polyglucose (6 – 7 gốc glucose) dưới tác dụng của - amylase, sau đó các oligosaccharide này tiếp tục bị phân cắt nên chuỗi bị ngắn dần và tạo thành maltotetrose, maltotriose, maltose. Sau thời gian dài tác dụng sản phẩm của quá trình thủy phân amylose là 13% glucose và 87% maltose.
Tác dụng thủy phân của - amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự trên amylose. Sản phẩm tạo thành là 72% maltose, 19% glucose ngoài ra còn có dextrin phân tử thấp và 8% isomaltose do - amylase không thể cắt được liên kết 1,6 glycozide ở mạch nhánh của phân tử amylopectin.
Khả năng dextrin hóa của - amylase là tính chất đặc trưng của enzyme này vì vậy
- amylase được gọi là enzyme dịch hóa hay enzyme dextrin hóa.
- amylase từ vi khuẩn và động vật đều được hoạt hóa bởi ion hóa trị I, còn - amylase từ thực vật thì được hoạt hóa bởi các ion hóa trị II.
- amylase
amylase
amylase
Dextrin hóa khi tăng độ acid
Tăng nhiệt độ Tăng độ phân nhánh Dextrin trắng
Dextrin hóa khi tăng độ acid
Giảm độ nhớt Giảm độ nhớt
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột dưới tác dụng của - amylase như sau:
Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
Phụ thuộc vào nhiệt độ phản ứng ta sẽ thu được các dextrin khác nhau (hình 17).
Hình 17. Sơ đồ tương quan giữa các dextrin
Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra - và trimaltose di - và monosacharide
Amylose oligosaccharide polyglucose
Maltose maltotriose maltotetrose
Dextrin hóa khi ở nhiệt độ thấp Dextrin hóa khi ở nhiệt độ cao
Tinh bột (trương)
Tăng nhiệt độ Tăng độ phân nhánh
Pyrodextrin
Hình 18. Quá trình thủy phân tinh bột xúc tác bởi enzyme amylase
- amylase
Hình 19. Enzyme - amylase
Đặc tính của enzyme - amylase
- amylase rất bền khi không có ion Ca2+ trong phân tử, bị kìm hãm bởi ion Cu2+ và Mg2+.
- amylase chịu nhiệt kém hơn - amylase nhưng bền với acid hơn, - amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 600C, nhiệt độ hoạt động tối thích của - amylase là 550C, pH từ 5,1 – 5,5.
Cơ chế tác dụng của - amylase
- amylase là một enzyme ngoại bào, - amylase phân cắt các liên kết - 1,4 - glycozide trong tinh bột, glycogen và các polysaccharit nhưng khi gặp các liên kết -1,4 - glycozide đứng kế cận - 1,6 - glycozide thì nó sẽ ngừng tác dụng.
- amylase thủy phân 100% amylose thành maltose.
- amylase thủy phân 54 – 58% amylopectin thành maltose. Phần còn lại là các polysaccharide có chứa nhiều - 1,6 - glycozide được gọi là - dextrin cho màu tím với iot.
- amylase hầu như không thủy phân các hạt tinh bột nguyên vẹn nhưng nó phân hủy hồ tinh bột rất mạnh.
Hình 20. Cơ chế tác dụng của - amylase lên tinh bột
Glucoamylase
Hình 21. Enzyme glucoamylase
Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết - 1,4 - glycozide lẫn - 1,6 - glycozide. Khi thủy phân liên kết - 1,4 - glycozide trong chuỗi polysaccharide. Glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo glucose.
Enzyme này còn có nhiều tên gọi khác như - amylase, amyloglucosidase, taka – amylase, maltulase,… là enzyme ngoại bào.
Ngoài các liên kết - 1,4 - glycozide và - 1,6 - glycozide glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết - 1,2 - glycozide và - 1,3 - glycozide.
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại amylase khác.
Glucoamylase thủy phân các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn các polysaccharide có phân tử nhỏ. Các phân tử có nhánh như amylopectin bị thủy phân khá nhanh.
Đa số các glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH = 3,5 – 5,5, ở nhiệt độ 500C. Glucoamylase bền với acid hơn enzyme - amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệ bởi ion Ca2+.
Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết - 1,4 - glycozide lẫn - 1,6 - glycozide. Khi thủy phân liên kết - 1,4 - glycozide trong chuỗi polysaccharide. Glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo glucose.
Các enzyme thủy phân liên kết 1,6 – glycozide
Sự phân ly tinh bột sẽ không hoàn toàn nếu như trong nhóm đường hóa không có các enzyme thủy phân được liên kết 1,6 – glycozide.
Người ta phân ra các nhóm sau:
Amilo - 1,6 - glucosidase hay 6 – glucanohitrolaza. Enzyme này có chứa trong một vài loại nấm mốc và nấm men. Tác dụng của enzyme này lên tinh bột thì yếu nhưng tác dụng rất tốt lên các - dextrin.
- enzyme R kiểu amylo - 1,6 - glucosidase. Enzyme này có chứa trong thực vật và thủy phân được điểm phân nhánh trong amilopectin và trong - dextrin. Hoạt độ tối ưu của enzyme này trong khoảng pH từ 6,5 – 7.
- oligo - 1,6 - glucosidase hay còn gọi là dextrinase enzyme này có pH tối ưu ở 6,2 – 6,4 thủy phân được liên kết 1,6 - glycozide trong isomaltose và các dextrin gồm một vài gốc glucose.
b. Quá trình thủy phân bởi enzyme
Phụ thuộc vào độ thuần khiết của các chế phẩm enzyme mà quá trình thủy phân tinh bột xảy ra với mức độ khác nhau.
Trong suốt quá trình thủy phân tinh bột bằng enzyme có 3 hiện tượng xảy ra: Hiện tượng dịch hóa
Hiện tượng dextrin hóa Hiện tượng đường hóa
Hiện tượng dịch hóa
Khi cho enzyme amylase tác dụng lên dung dịch hồ tinh bột hiện tượng đầu tiên ta nhìn thấy được là độ nhớt của dung dịch giảm dần và dung dịch bị loãng ra. Trong giai đoạn này hình thành nên dextrin và một lượng nhỏ đường. Như vậy có thể cho rằng dịch hóa là sự phá hủy các tập hợp tinh bột thành những phân tử riêng biệt rồi lại tiếp tục phân ly những phân tử này thành các dextrin phức tạp.
Có thể làm tăng quá trình dịch hóa bằng cách thêm các chất làm tăng hoạt độ của enzyme hay các chất ổn định enzyme, tách các chất kìm hãm enzyme có trong nguyên liệu thông thường là các ion Cu2+.
Hiện tượng dextrin hóa
Dextrin là những sản phẩm khác nhau của quá trình thủy phân tinh bột bằng acid hay bằng enzyme.
Trong quá trình phân ly các phân tử tinh bột bị ngắn dần do đó độ nhớt của dung dịch giảm dần và phản ứng với iot cũng thay đổi từ màu xanh sang đỏ rồi chuyển thành màu nâu và cuối cùng là không màu.
Theo cơ chế tác dụng của enzyme có thể phân ra các dạng dextrin như sau:
Nếu cho - amylase thuần khiết thủy phân tinh bột thì trong toàn bộ quá trình sẽ thấy xuất hiện đầy đủ các kiểu dextrin khác nhau và một lượng nhỏ đường khử.
Dạng dextrin hóa thứ 2 đặc trưng với - amylase thuần khiết. Trong điều kiện này tinh bột nhanh chóng chuyển thành maltose và - dextrin. Dextrin này được gọi là - amilodextrin.
Dạng dextrin hóa thứ 3 xảy ra do tác dụng tổ hợp của amylase, ở đây sự tạo thành đường khử và các dextrin không cho màu xanh với iot.
Hiện tượng đường hóa
Quá trình đường hóa là quá trình phân ly tinh bột thành đường đơn giản như glucose hoặc maltose.
Quá trình đường hóa có thể chia ra làm các kiểu sau:
Trường hợp tác nhân đường hóa duy nhất là enzyme amylase. Trong trường hợp này phần lớn sự đường hóa không phải tác dụng trực tiếp lên tinh bột mà do sự phân ly các dextrin sau này.
Nếu tác nhân thủy phân là amylase thì sự đường hóa xảy ra nhanh chóng trong giai đoạn đầu và thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ amylase. Trong
trường hợp này sự tạo thành đường giảm dần trong giai đoạn sau và kết thúc khi 60% tinh bột đã được chuyển thành maltose.
Kiểu đường hóa khác xảy ra khi tác nhân thủy phân tinh bột là tổ hợp của - amylase và - amylase. Trong giai đoạn đầu dextrin tạo thành nhanh và cũng kèm theo sự tạo thành đường maltose. Trong giai đoạn tiếp theo phản ứng xảy ra chậm nhưng đường vẫn được tạo thành rất liên tục và đều đặn cho đến khi tinh bột hoàn toàn chuyển thành đường.