Trực khuẩn ruột già Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae,
nhóm Escherichea, loài Escheria. Trong các vi khuẩn đường ruột, loài
Escheria là phổ biến nhất.
Escherichia coli còn có tên là Bacterium coli commune, Bacillus coli communis do Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em. Theo Bald
Escherich, nơi cư trú chính của chúng thường ở phần sau của ruột, ít khi ở dạ dày hay phần trước ruột của các loài động vật như: ngựa, bò, dê, lợn, chó, mèo, gia cầm và người. Chúng theo phân của người hay gia súc mà gieo rắc ra ngoài. Loài vật ăn thịt là loài hỗn thực bài tiết nhiều E.coli hơn loài ăn cỏ.
E.coli xuất hiện và sinh sống trong động vật chỉ vài giờ sau khi sinh và tồn tài
cho đến khi con vật chết. Ở điều kiện bình thường của chúng E.coli không gây bệnh, khi các điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc, vệ sinh thú y kém dẫn đến sức chống đỡ của con vật suy giảm thì vi khuẩn E.coli trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh.
* Đặc điểm về hình thái
Theo Nguyễn Như Thanh và cs (1997) [18] vi khuẩn E.coli là một trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, kích tước 2 - 3 x 0,6µm. Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Có khi nuôi trong môi trường nuôi cấy thấy có những trực khuẩn dài 4 - 8µm, những loài này thường gặp trong canh khuẩn già. Phần lớn E.coli di động có lông xung quanh thân, nhưng một số không thấy di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô.
Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu. Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc để nhuộm có thể thấy giáp mô. Dưới kính hiển vi điện tử người ta còn phát hiện được cấu trúc pili, yếu tố mang kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E.coli.
* Đặc tính nuôi cấy
Vi khuẩn E.coli dàng phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp nên ta chọn chúng đê nghiên cứu về sinh vật học.
E.coli là trực khuẩn hiếu khí, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5 - 400C,nhiệt độ thích hợp nhất là 370
C. pH thích hợp nhất là 7,2 - 7,4, phát triển từ pH từ 5,5 - 8.
* Trên môi trường thạch thường:
Sau 24 giờ, nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, bóng, láng, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 - 3 mm. Nuôi lâu khuẩn lạc chuyển sang màu gần như lâu nhạt và mọc rộng ra.Có thể thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và dạng M (Mucoid).
- Trên môi trường nước thịt: Sau khi nuôi cấy 24 giờ, ở 370C, vi khuẩn
E.coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi phân hôi thối. (H2S).
- Trên môi trường thạch máu: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370
C hình thành khuẩn lạc dạng to, ướt, lồi, viên không gọn, màu sang, có thể có hoặc không có dung huyết tùy thuộc vào chủng.
- Trên môi trường thạch MacConkey: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370
C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc màu hồng, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
- Trên môi trường Endo: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, có hoặc không có ánh kim.
- Trên môi trường EMB (Esin Methyl Blue): sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc màu tím đen và có ánh kim.
- Trên môi trường SS: E.coli có khuẩn lạc có màu đỏ.
- Trên môi trường thạch Brilliant Green Agar: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn E.coli hình thành khuẩn lạc dạng S (smooth), màu vàng chanh. Theo Nguyễn Như Thanh và cs (1997) [18] vi khuẩn E.coli có một số đặc tính sinh hóa sau:
- Lên men sinh hơi các loại đường
Echerichia coli gồm những trực khuẩn di động hoặc không di động, có
khả năng lên men sinh hơi các loại dường Glucoza, Fructoza, Galactoza, Lactoza, Manitol, Levuloza, Xyloza. Lên men không chắc chắn với loại đường Dulcitol, Sacaroza, Lactose, trong khi đó vi khuẩn salmonella spp thì không có đặc tính này, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn
E.coli và Salmonella spp. * Một số phản ứng khác, bao gồm: Indol : + Di động : + MR : + Catalase : + VP : - H2S : - Citrate : - Ureeaza : - (+): Phản ứng dương tính; (-): Phản ứng âm tính
- Làm đông sữa sau khi ủ ở 370C trong vòng 24 - 72 giờ. - Không làm tan chảy Gelatin.
- Vi khuẩn E.coli có khả năng khử Nitrat thành Nitri, khử Cacboxyl trong môi trường Lysine decaborxylase.
* Sức đề kháng:
Vi khuẩn E.coli không hình thành nha bào nên sức đề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt độ 550C trong 1 giờ hoặc 600C trong 30 phút, đun sôi 1000
C thì chết ngay. Những chủng E.coli trong phân có xu hướng đề kháng với nhiệt cao hơn những chủng phân lập được ở môi trường bên ngoài. Ở môi trường bên ngoài, các chủng E.coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng.
* Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E.coli
Dựa vào cấu trúc bề mặt và cấu trúc bên trong của tế bào vi khuẩn
E.coli các nhà khoa học đã xác định được cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E.coli bao gồm các kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên long H
(Flagellar), kháng nguyên vỏ K (Capsular) hoặc còn gọi là kháng nguyên OMP (Outer Membrane protein) và kháng nguyên F (Fimbriae).
Cho đến nay đã xác định ít nhất 170 type kháng nguyên O, 70 kháng nguyên type K, 56 kháng nguyên type H và một số kháng nguyên type F (Bertschinger H.U và cs (1992) [24]).
Bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học đã phát hiện được tính chất phức tạp các yếu tố kháng nguyên của vi khuẩn E.coli, bao gồm các loại kháng nguyên sau:
* Kháng nguyên O (Somatic)
Theo Zinner và Peter (1983) [31] đây là thành phần chính của vi khuẩn và cũng được coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn. Kháng nguyên O được coi như một loại độc tố, có thể tìm thấy ở màng ngoài vỏ của vi khuẩn và thường xuyên được giải phóng vào môi trường nuôi cấy. Trong trạng thái triết xuất tinh khiết, nó có bản chất là Lypoppolisaccharide, bao gồm 2 nhóm sau:
- Polysaccharide không có nhóm Hydro nằm thành ngoài vi khuẩn, mang tính đặc trưng cho kháng nguyên từng giống.
- Polysaccharide không có nhóm Hydro nằm ở phía trong, không mang tính đặc trưng mà chỉ tạo ra sự khác biệt về khuẩn lạc (từ dạng S sang dạng R) Kháng nguyên O có những đặc tính sau: Chịu được nhiệt (không bị phá hủy khi đun nóng ở 1000
C trong 2 giờ); các chất cồn, acid HCl nồng độ 1N chịu được 20 giờ. Kháng nguyên O rất độc chỉ cần 1/20 mg đã đủ giết chết chuột nhắt trắng sau 24 giờ, nhưng bị hủy bởi Formol 0,5 %
Kháng nguyên O được cấu trúc bởi các phân tử lớn với thành phần các phân tử gồm:
• Protein: Làm cho phức hợp có tính kháng nguyên • Polyosit: Tạo ra tính đặc hiệu của kháng nguyên • Lypit: Kết hợp với Polyohsit và là cơ sở của độc tính * Kháng nguyên H (Flagellar)
Là kháng nguyên có trên lông của vi khuẩn, có bản chất là protein, kém bền vững so với kháng nguyên O.
Kháng nguyên h có các đặc tính sau: Bị phá hủy ở 600
C trong 1 giờ. Dễ bị cồn, acid yêu và các Enzym phân giải protein phá hủy, nhưng kháng nguyên H vẫn tồn tại khi xử lý Formol 0,5 %.
Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết lại với nhau nhờ lông dính với lông. Các kháng thể H cố định trên lông và là cầu nối với các bên cạnh. Kết quả tạo nên những hạt ngưng kết giống như cục bông nhỏ. Các hạt ngưng kết rất dễ tan khi lắc vì lông rất nhỏ, dài và đễ đứt. Các vi khuẩn di động khi tiếp xúc với kháng nguyên H tương ứng sẽ trở thành không di động.
Kháng nguyên H của vi khuẩn E.coli không có vai trò về động lực, đồng thời không có vai trò trong đáp ứng miễn dịch nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có tác dụng rất lớn trong xác định giống, loài của vi khuẩn.
* Kháng nguyên K(capsular)
Là kháng nguyên bao quanh thân vi khuẩn, có bản chất hóa học là 0
C, kháng nguyên này ngăn cản sự ngưng kết của kháng nguyên O với kháng nguyên O tương ứng. Khi đun nóng 100 - 1210C kháng nguyên K sẽ mất tác dụng ngăn cản này.
Kháng nguyên K có 2 nhiệm vụ chính:
- Hỗ trợ phản ứng ngưng kết với kháng nguyên O, vì vậy thường được nghi với kháng nguyên O trong cấu trúc kháng nguyên. Ví dụ như: E.coli O141K58ab; E.coli O139K58ac.
- Tạo ra hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại lại và hiện tượng thực bào.
Kháng nguyên K gồm 3 loại chính: L, A, B căn cứ vào đặc điểm vật lý, khả năng chịu nhiệt, khả năng ngưng kết tố,ức chế ngưng kết để phân loại kháng nguyên. Hiên nay, vi khuẩn E.coli có 89 kháng nguyên K trong đó: 31 loại L; 32 loại B; 26 loại A.
Kháng nguyên K và yếu tố bám dính là yếu tố quyết định quá trình sinh bệnh của vi khuẩn sống ở đường điêu hóa. Để thực hiện chức năng này, mỗi loài vi khuẩn đều sản sinh ra yếu tố đặc trưng, yếu tố này có cấu trúc đặc biệt phù hợp với cấu trúc của từng điểm tiếp nhận ở trên tế bào nhung mao ruột. Đối với các giống E.coli phân lập từ lợn con bị bệnh thì kháng nguyên K88 đóng vai trò quan trọng trong việc bám dính. Kháng nguyên K88 được cấu tạo bởi các acid amin phân cực và không phân cực, trong đó tỷ lệ không phân cực chiếm 52%. Kháng nguyên K88 là yếu tố độc lực của vi khuẩn E.coli và thường liên kết với một số serotype xếp theo kháng nguyên O sau: O8K88;
Vậy kháng nguyên K với bản chất là Polysaccharide có nhiệm vụ nhất định trong khả năng gây bệnh không chỉ với vi khuẩn E.coli mà cả với các vi khuẩn đường ruột khác khi xâm nhập vào hệ thống tiêu hóa.
* Kháng nguyên giáp mô (kháng nguyên vỏ bọc)
Một số vi khuẩn trong quá trình phát triển tiết ra chất nhầy có khả năng tan vào nước ở một mức nhất định, những chất này bao xung quanh bên ngoài vách vi khuẩn giúp vi khuẩn chống lại tác động môi trường chống lại ngoại cảnh, có thể quan sát được ở trạng thái ướt, dễ bị mất đi khi thay đổi điều kiện phát triển gọi là giáp mô (capsule) (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997) [18].
* Kháng nguyên Fimbriae (kháng nguyên pili)
Ở nhiều vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn E.coli nói riêng, ngoài lông ra còn có các bộ phân khác hình sợi gọi là pili. Pili hay Fimbriae có bản chất là protein bao phủ lên toàn bộ bề mặt tế bào vi khuẩn(Orskov, 1980) [28].
* Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli
Vi khuẩn E.coli trở thành vi khuẩn gây bệnh khi có các yếu tố gây bệnh quan trọng sau:
- Các yêu tố không phải độc tố
+ Khả năng bám dính của vi khuẩn: Khả năng bám dính là yếu tố vô cùng quan trọng để thực hiện bước đầu tiên trong quá trình gây bệnh của vi khuẩn E.coli. nhờ có yếu tố bám dính E.coli cố định vào các tế bào biểu mô của niêm mạc ruột mà không bị rửa trôi bởi nhu động và đẩy ra ngoài theo phân.
+ Khả năng xâm nhập của vi khuẩn E.coli: Sau khi bám dính vi khuẩn sẽ xâm nhập vào sâu bên trong lớp tế bào. Tại đây E.coli phát triển nhân lên với tốc độ lớn, sản sinh độc tố đường ruột làm phân rã cấu trúc tế bào gây phản ứng viêm, sốc nhiễm khuẩn và sau cùng là tiêu chảy nặng (Lê Đình Doanh, Nguyễn ĐÌnh Mão, 1997) [1].
+ Khả năng dung huyết (Hly): Các chủng E.coli độc có khả năng sản sinh men Haemolyzin để phá hủy hồng cầu vật chủ, giải phóng Fe+++
dùng cho mình trong quá trình phát triển, vì vậy, đây là một trong những yếu tố độc lực quan trọng của các chủng E.coli gây bệnh.
Có 4 kiểu dung huyết của E.coli nhưng quan trọng nhất là kiểu anpha và beta. Trong đó kiểu beta gắn với tế bào vi khuẩn do vậy mà không có tác dụng độc lực (Smith, 1963) [30].
+ Yếu tố kháng khuẩn của vi khuẩn đường ruột (Colicin V): Trong quá trình phát triển, E.coli thường sản sinh ra yếu tố cạnh tranh được gọi là Colicin V, một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn khác. Khi tồn tại cộng sinh với nhiều loại vi khuẩn khác nhau, E.coli nhờ có Cilicin V kháng lại các vi khuẩn có lợi làm cho mình trở thành vi khuẩn chiếm ưu tiên trong đường ruột gây lên hiện tượng loạn khuẩn.
+ Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột: Các chủng E.coli độc có thể mang một hay nhiều gen sản xuất ra các loại protit kháng lại một số loại kháng sinh, nằm trên Plasmid R, có trong tế bào của một số vi khuẩn Gram âm, Gram dương, trong đó có E.coli. Plasmid này có thể di chuyển dọc và di chuyển ngang cho tất cả các quần thể vi khuẩn thích hợp (Falkow và cs, 1987) [25].
* Các độc tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli
Các chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh sản sinh các loại độc tố phổ biến gồm độc tố đường ruột (Enterotoxin); độc tố thần kinh (Neurotoxin). Trong đó, loại độc tố quan trọng trong gây bệnh tiêu chảy cho lợn con là độc tố dường ruột thuộc về các chủng E.coli thuộc nhóm Enterroxigenic E.coli là chủ yếu.
- Độc tố đường ruột (Enterotoxin) bao gồm: E.coli gây bệnh sản sinh ra nhiều loại độc tố, mỗi loại độc tố có cơ chế tác động khác nhau và gây ra thể bệnh khác nhau, bao gồm:
+ Ngoại độc tố: Là loại độc tố không chịu được nhiệt, độc tố này bị vô hoạt ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút. Dưới tác dụng của Formol và nhiệt độ thì ngoại độc tố mất độc tính nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên, dung làm giải độc tố. Ngoại độc tố có hướng thần kinh và gây hoại tử.
+ Nội độc tố: Chúng nằm trong tế bào vi khuẩn và gắn với tế bào rất chặt. Nội độc tố chỉ giải phóng khi tế bào bị phá vỡ. Nội độc tố có cấu trúc Polysaccharide - Protein - Lipit, thuộc về kháng nguyên hoàn hảo và có tính đặc hiệu cao với mỗi chủng serotype. Nội độc tố có thể chiết xuất Acid Trichloaxetic, Phenol và dưới tác dụng của Enzym (Đào Trọng Đạt và cs, 1995) [2].