kHảo sát hợp chất kháng staphylococcus aureus kháng methicillin (mrsa) từ chủng bacillus sp rd26 được phân lập từ cây diệp hạ châu đắng (phyllathus amarus schum et thonn) nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN KHẢO SÁT HỢP CHẤT KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN (MRSA) TỪ CHỦNG BACILLUS SP.RD26 ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (PHYLLATHUS AMARUS SCHUM.ET THONN) Sinh viên thực hiện: Nguyễn Vương Hạ Quỳnh Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh TP Hồ Chí Minh, 2018 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG IV DANH MỤC BIỂU ĐỒ V DANH MỤC HÌNH ẢNH V DANH MỤC VIẾT TẮT VI ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU ĐỀ TÀI: CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN (MRSA) 1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin 1.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh Staphylococci 1.2.1 Đề kháng  - lactams 1.2.2 Đề kháng Penicillin 1.2.3 Đề kháng Methicillin 1.2.4 Đề kháng Vancomycin 1.3 Tình hình MRSA kháng kháng sinh giới Việt Nam ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 11 2.1 Sơ lược Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schunm.et thonn) 11 2.2.1 Đặc điểm thực vật học 11 2.1.2 Đặc điểm hình thái 12 2.1.3 Phân bố 12 2.1.4 Công dụng thuốc đặc trị bệnh từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum Et Thonn) 12 2.2 Vi khuẩn nội sinh 13 I 2.3 Vi khuẩn Bacillus 14 2.3.1 Phân loại 14 2.3.2 Hình dạng kích thước 14 2.3.3 Đặc điểm nuôi cấy 15 2.3.4 Ứng dụng Bacillus 15 3.PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 16 3.1 KHÁI NIỆM 16 3.2 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 17 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN DỊCH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC – MS 18 4.1 Giới thiệu sắc kí ghép khố phổ 18 4.2 Đặc điểm 18 4.3 Sắc ký khí 19 4.4 Nguyên tắc hoạt động sắc ký khí 19 TÌNH HÌNH CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN KHÁNG VI KHUẨN KHÁNG THUỐC 20 5.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng vi khuẩn kháng thuốc giới 20 5.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng vi khuẩn kháng thuốc Việt Nam 21 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 VẬT LIỆU 24 1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 24 1.2 Chủng vi sinh vật nghiên cứu 24 1.3 Mơi trường – hóa chất 24 1.4 Thiết bị dụng cụ 24 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Tái kiểm tra 26 2.1.1 Tái phân lập chủng Bacillus sp RD26 26 2.1.2 Lên men chủng Bacillus sp RD26 môi trường tối ưu 27 2.1.3 Chuẩn bị thí nghiệm 28 2.1.3.1 Chuẩn bị môi trường 28 II 2.1.3.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn MRSA 28 2.1.3.3 Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm 28 2.1.4 Tái kiểm tra hoạt tính kháng MRSA chủng Bacillus sp.RD26 28 2.1.4.1 Tiến hành thử nghiệm 28 2.1.4.1 Kết 29 2.2 Khảo sát ảnh hưởng pH nhiệt độ đến độ bền dịch lên men chủng Bacillus sp.RD26 29 2.1 Khảo sát ảnh hưởng pH đến độ bền dịch lên men chủng Bacillus sp.RD26 29 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền dịch lên men chủng Bacillus sp RD26 thử nghiệm 30 2.2.2.4 Tiến hành thử nghiệm 30 2.3 Tách chiết đánh giá hợp chất kháng khuẩn sau thu nhận 31 2.4 Xác định thành phần hợp chất phương pháp GC - MS 32 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 KẾT QUẢ 34 3.1 Tái kiểm tra chủng Bacillus sp RD26 34 3.1.1 Tái kiểm tra 34 3.1.1.1 Tái phân lập chủng Bacillus sp RD26 34 34 34 3.1.2 Tái kiểm tra hoạt tính kháng phương pháp khếch tán giếng thạch 34 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến độ bền hoạt tính kháng khuẩn Bacillus sp RD26 36 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến dịch lên men kháng khuẩn thu nhận từ chủng Bacillus sp RD26 39 3.4 Kết tách chiết đánh giá hợp chất kháng khuẩn sau thu nhận 41 3.5 Kết xác định thành phần hợp chất kháng khuẩn phương pháp GC – MS 43 3.5.1 Thành phần hóa học dịch Methanol 43 3.5.1 Thành phần hóa học dịch Ethanol 44 III 3.6 So sánh thời gian lưu dịch mẫu có Ethanol Methanol 46 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 4.1 KẾT LUẬN 49 4.2 ĐỀ NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC MƠI TRƯỜNG – HĨA CHẤT PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC – MS DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết tái phân lập chủng Bacillus sp.RD26 môi trường tối ưu …………………………………………………………………………………… 34 Bảng 3.2 Kết thử khả kháng phương pháp khuếch tán giếng thạch 35 Bảng 3.3 Kết khảo sát khả ảnh hưởng hoạt tính kháng khuẩn đến độ bền Bacillus sp.RD26 pH 37 Bảng 3.4 Kết khảo sát khả ảnh hưởng hoạt tính kháng khuẩn đến độ bền Bacillus sp.RD26 nhiệt độ 40 Bảng 3.6 Kết tách chiết đánh giá hợp chất kháng khuẩn sau thu nhận 441 Bảng 3.7 Thành phần hóa học dịch Methanol 43 Bảng 3.8 Thành phần hóa học dịch Ethanol 44 Bảng 3.9 Thời gian lưu peak 47 IV DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Khả ảnh hưởng độ bền hoạt tính kháng khuấn dịch lên men 31 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên độ bền dịch kháng khuẩn chủng Bacillus sp RD26 38 Biểu đồ 3.4 Kết tách chiết hợp chất kháng khuẩn dung môi thử…… ………………………………………………………………… ………42 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Hình vi thể MRSA Hình 1.2 Cơ chế kháng Penicillin Methicillin Staphylococcus aureus Hình 1.2.4 Cơ chế Vancomycin VISA Những chủng VISA tổng hợp thêm lượng peptidoglycan đồng thời gia tăng D- Ala-D-Ala Những phần Ala nối với Vancomycin ngăn không cho tiến đến gần màng tế bào vi khuẩn Hình 1.3 Tỷ lệ mà Staphylococcus aureus xâm kháng Methicillin (MRSA) 19 quốc gia Kosovo (theo Nghị 1244 (1999) Liên hợp quốc CAESAR 30 quốc gia EARS-Net; với quốc gia thành viên khu vực Châu Âu qua mạng lưới giám sát Trung Á Đông Âu mạng lưới kháng kháng sinh năm 2016 Hình Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schunm.et thonn) 11 Hình 2.3 Hình vi thể Bacillus 14 Hình Sự phân bố chất tan hai pha lỏng 17 Hình 4.1 : Sơ đồ hệ thống GC 20 Hình 2.5 Kết kháng khuẩn vi khuẩn thử nghiệm 29 Hình 3.2 Hình thái đại thể Bacillus sp RD26 24 34 Hình 3 Hình thái vi thể Bacillus sp RD26 24 (100x) 34 V Hình 3.4 Kết thử khả kháng MRSA giếng khuếch tán chủng Bacilus sp RD26 36 Hình 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến độ bền hoạt tính kháng khuẩn 39 Hình 3.6 Kết tách chiết chất kháng khuẩn dung môi Ethanol Methanol42 DANH MỤC VIẾT TẮT MT Môi trường v/p Vòng/phút TB Tế bào nm nanomet Cs Cộng Gram (-) Gram âm Gram (+) Gram dương MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus “Staphylococcus aureus kháng Methicillin” ICU Intensive care unit “Đơn vị hồi sức cấp cứu, điều trị tích cực, chăm sóc đặc biệt” CDDEP Center for disease dynamics, economics & policy “Trung tâm động dịch bệnh, kinh tế sách” CLSI Tiêu chuẩn Phịng thí nghiệm Lâm sàng VI VII ĐẶT VẤN ĐỀ Staphylococcus aureus tác nhân gây nhiễm trùng hội, đặc biệt nhiễm trùng bệnh viện Hơn nữa, tác nhân nhiễm trùng hội trở nên đề kháng với nhiều loại kháng sinh Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) chủng tụ cầu vàng kháng Methicillin kháng sinh thuộc nhóm 𝛽lactam Penicillin Cephalosporin MRSA lần báo cáo Châu Âu vào năm 1960 số lượng vi khuẩn kháng thuốc gia tăng suốt thập kỷ qua Một nghiên cứu đa trung tâm thực 235 chủng Staphylococcus aureus phân lập từ trường hợp lâm sàng nhiễm khuẩn Staphylococcus aureus cho thấy tỉ lệ MRSA 47% (Vân PH cs, 2005) Theo số liệu nghiên cứu KONSAR từ 2005 – 2007 bệnh viện Hàn Quốc cho thấy vi khuẩn MRSA chiếm 64% Năm 2017, WHO công bố danh sách mức độ quan trọng kháng sinh bị kháng bao gồm Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobactericeae kháng Carbapenem nằm mức độ quan trọng Bên cạnh vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin vancomycin nằm mức cao (WHO, 2017) Hiện nhà khoa học giới bước đầu nghiên cứu tìm số hợp chất kháng khuẩn từ vi sinh vật nội sinh Trong đó, vi khuẩn nội sinh xem nguồn tiềm thay kháng sinh Các hợp chất sinh học tự nhiên0 sản xuất vi khuẩn nội sinh có nhiều ứng dụng tiềm ngành công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp công nghệ sinh học Các hợp chất tự nhiên thu từ vi khuẩn nội sinh tìm thấy có khả kháng khuẩn, kháng nấm ví dụ Ecomycins, Pseudomycins, Munumbicins Xiamycins, kháng virus, chống ung thư, chống oxy hóa, đái tháo đường ức chế miễn dịch (Christina cs., 2013) Năm 2008, Olffa Tabbene cộng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn chủng Bacillus subtilis B38 vi khuẩn kháng thuốc MRSA Đến năm 2010, Olffa Tabbene cộng xác định hợp chất S07-2, hợp chất có khối lượng phân tử 905,6Da thử nghiệm kháng lại Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes Enterococcus feacalis (Olffa Tabbene cs., 2010) Theo Sunkar cộng sự, năm 2013 phân lập xác định vi khuẩn nội sinh Brassica oleracea khả sinh enzym amylase, protease, cellulase tiềm sản xuất enzym đồng thời có kháng khuẩn Klebsiella Pneumoniae (20mm), Staphylococcus aureus (25mm) (Sunkar cs., 2013) Ở Việt Nam, chưa có cơng trình nghiên cứu nhiều hợp chất kháng vi khuẩn kháng thuốc vi khuẩn nội sinh Do đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài “Khảo sát hợp chất kháng Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) từ chủng Bacillus sp RD26 phân lập từ Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum Et thonn)”, nghiên cứu này, sử dụng chủng Bacillus sp RD26 phân lập từ Diệp Hạ Châu Đắng Bacillus sp RD26 thừa kế từ cơng trình nghiên cứu trước Chúng tơi nghiên cứu đánh giá khả kháng MRSA tối ưu hóa mơi trường để sinh hợp chất có nhiều kháng khuẩn cao Mục tiêu đề tài: Khảo sát hợp chất kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) từ chủng Bacillus sp RD26 phân lập từ Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum Et thonn) Nội dung đề tài: - Tái kiểm tra chủng Bacillus sp RD26 môi trường tối ưu - Khảo sát ảnh hưởng pH đến độ bền dịch lọc kháng khuẩn - Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền dịch lọc kháng khuẩn - Khảo sát dung môi phù hợp để thu nhận hợp chất dịch chiết - Phân tích dự đốn chất có dịch mẫu kháng MRSA TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [01] Bộ Y tế (2015), “Hướng dẫn sử dụng kháng sinh”, trang 22 - 69 [02] Nguyễn Hữu An, Trần Thị Tuyết Nga, Cao Hữu Nghĩa, Vũ Lê Ngọc Lan (2013 , Tỷ lệ kháng kháng sinh Staphylococcus aureus mẫu bệnh phẩm Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh , Tạp chí Y học dự phòn , tập XXIII, số 10(146) , trang 270 [03] Nguyễn Thị Thu Ba (2011), Cơ chế đề kháng kháng sinh số vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc [04] Phạm Văn Cường (2015), “ đề án nghiên cứu tiềm dược liệu biển vùng biển Đông Bắc Việt Nam” [05] Nguyễn Đức Quỳnh Như (2008), “Sàng lọc in vitro số chủng Bacillus làm probiotic cho thuỷ sản”, Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh [06] Lê Đăng Hà cs, ( 1999), “ Vấn đề kháng kháng sinh vi khuẩn”, cục quản lý Dược Bộ y tế [07] Trần Thị Như Hằng cộng (2009), “Xác định cấu trúc thử hoạt tính sinh học ergosterol perxod phân lập từ chủng nấm Trichoderma konilangbra nội sinh Khổ Sâm (Croton tonkinensis Gapnep)”, Tạp chí dược học, 400, tr 60-65 [08] Trần Linh Thước (2010), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nhà xuất Giáo Dục Việt Nam [09] Phan Thị Hồi Trinh cộng (2016), “ Hoạt tính kháng khuẩn số chủng vi khuẩn phân lập từ bọt biển vùng đảo phú quốc, Việt Nam”, Tạp chí sinh học (2016), 38(1): 109-114 [10] Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông (2009), Công nghệ sinh học Dược, Nhà xuất Y học [11] Phạm Hùng Vân , Phạm Thái Bình (2013), kháng sinh – đề kháng kháng sinh kỹ thuật kháng sinh đồ, vấn đề thường gặp, Nhà xuất Y học , tr 19 – 27, 35, 51-60 51 [12] Phạm Hùng Vân, Phạm Thái Bình (2005), “Tình hình đề kháng kháng sinh vi khuẩn Staphylococcus aureus Kết nghiên cứu đa trung tâm thực 235 chủng vi khuẩn”, Tạp chí Y học Thực Hành, số 513, tr 244 – 248 Tài liệu Tiếng Anh [13] Abriouel H., Franz C., Ben O.N., Gaslvez A (2011), “Diversity and applications of Bacillus bacteriocins” Microbiol, 35, pp 201-232 [14] Amadou C.K (1998) Promoting Alternative Medicine Africa Health Journal, pp 2025 [15] Arun Kumar G., Robert Antony A., V Rajesh Kannan., 2015, “Exploration of endophytic microorganisms from selected medicinal plants and their control potential to multi drug resistant pathogens”, Journal of Medicinal Plants Studies 3(2), pp 49- 57 [16] Berkeley R., Heyndrickx M., Logan N., Vos D P (2002), Applicationsand Systematics of Bacillus and Relatives, Blackwell Publishing [18] CDC Update (1997): Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to Vancomycin – United states.MMWR; 46:813-814 [19] Chanway C P (1997), “Inoculation of tree roots with PGPR soil bacteria: an emerging technology for reforestation” , Forest Science, 43 (1), pp 99 – 112 [20] Chen P T., Chiang C J., Chao Y P (2007), “Medium Optimization for the Production of Recombinant Nattokinase by Bacillus subtiis Using Response Surface Methodology”, Biotechnol, (23), pp 1327 – 1332 [21] Christina A., Christapher V., Bhore S.J (2013), “Endophytic bacteria as a source of novel antibiotics: An overview”, Pharmacogn Rev, 7(13), pp 11˗16 [22] Jones R.N (2001), “Resistance patterns among nosocomial pathogens: trends over the past few years”, Chest 2001, 119(2), pp 397-404 [23] ELLEN JOBARON (1990), Bailey and Scoott’s Diagnotic Microbiology, 8th, Mosby 52 [24] GARP – Vietnam (2010), “Situation Analysis on Antibiotic Use and resistance in Vietnam”, Global Antibiotic Resistance Partnership (GARP) – Vietnam, Hanoi, Vietnam [25] Guo B., Wang Y., Sun X., Tang X (2008), “Bioactive natural products from endophytes: a review”, Applied Biochemistry and Microbiology, 44(2), pp 136 – 142 [26] Hong H A., Duc L H., Cutting S M (2005) “The use of bacterial spore formers asprobiotics”, FEMS Microbiol Rev 29(4), pp 813 –835 [27] Ahmed Kamal, Mohammed Ali Hussaini Syed & Shaheer Malik Mohammed (2015), “Therapeutic potential of benzothiazoles: a panten review”, CSIR- Indian Institute of Chemical Technology, Medicival Chemistry and Pharmacology Hyderabad, India [28] Hemamalini V., Kavitha V., Ramachandran S (2015 , In vitro antibiogram pattern of Staphylococcus aureus isolated from wound infection and molecular analysis of mecA gene and restriction sites in Methicillin resistant Staphylococcus aureus , Journal of Advanced Pharmaceutical Technology, 6(4), pp 170- 175 [29] Karpin j W., Morris D M, 2015, “Transition metal diamine complexes with antimicrobial activity against Staphylococcus aureus and Methicillin – resistan S.aureus (MRSA)”, Med Chem Comm, 6, pp 1471 – 1478 [30] Kim J (2000), “Isolation and purification of antifungal compound and lactamase inhibitor from endophytic bacteria”, Master's thesis, Seoul National University [31] Kumar A., Saini P., Shrivastava J N (2009) “Production of peptide antifungal antibiotic and biocontrol activity of Bacillus subtilis”, Indian Journal of Experimental Biology 47(1), pp.57 – 62 [32] Klaenhammer T(1993), “Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria”, Microbiol, 12, pp 39-86 [33] McDonald LC, Lauderdale TL, Shiau YR, Chen PC, Lai JF, Wang HY, Ho M; (2004), The status of antimicrobial resistance in Taiwan among Grampositive pathogens:the Taiwan Surveillance of Antimicrobial Resistance TSAR programme , 23(4), pp 362-370 53 [34] Phongpaichit S., Rụngindamai N., Rukachaisirikul V., Sakayaroj J (2006), “Antimicronial activity cultures of endophytic fungi isolated from Garcinia species”, FEMS Immunol Med Microbiol 48, pp 367- 372 [29] Rybak MJ, Laplante KL (2005), “Community-associated- Methicillin- resistant Staphylococcus aureus”, pp.74-85 [30] Ryan R.P., Germaine K., Franks A., Ryan D.J., Dowling D.N (2008), “Bacterial endophyte : recent development andapplication ”, FEMS Microbiol Lett, 278, pp – [31] Olfa Tabbene & Imen Ben Slimene & Faten Bouabdallah & Maria-Luisa Mangoni & Maria-Camino Urdaci & Ferid Limam (2008) “Production of Anti-Methicillin-Resistant Staphylococcus Activity from Bacillus subtilis sp Strain B38 Newly Isolated from Soil”, Tunisia [32] Olfa Tabbene, Ines Karkouch, Salem Elkahoui, Pascal Cosette, Maria-Luisa Mangoni, Thierry Jouenne, Ferid Limam ( 2009) “ A new antibacterial and antioxidant S07-2 compound produced by Bacillus subtilis B38”, Universiti La Sapienza, Rome, Italy [33] Tverdek FP, Crank CW, Seqretu J.(2008), “ Antibiotic therapy of methicillin- resistant Staphyloccoccus aureus in critical care”, Crit Care Clin, 24(2):249-60 [34] Stefani S, Bongiorno D, Cafiso V (2009), “Pathatype and susceptibility profile of a community- acquired Methicillin- resistant Staphylococcus aureus strain resposible for a case of severe Pneumonia, Diagn Microbiol Infect Dis; 63(1):100 – 4.36 [35] Schulz B., Boyle C (2006), “What are endophytes”, Springer-Verlag; 20, pp.1–13 [36] Simonsen G S., Tapsall J W., Allegranzi B., Talbot E A., Lazzari S (2004), “The antimicrobial resistance containment and surveillance approach – a public health tool”, Bulletin of World Health Organization 2004, 82(12), pp 928 - 934 [37] Sunkar S and Nachiyar C V (2013), “Isolation and characterization of an endophytic bacterium from Brassica Oleracea with potential enzyme and antibacterial activity”, Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 6(2), pp 183 – 187 [38] Strobel G., Daisy B., Castillo U., Harper J (2004), “Natural products from endophytic microorganisms”, J Nat Prod, 67, pp 257 – 268 54 [39] Shrivastava A., Mahendra K G., Singhal P K (2013), “Nutritional and environmental optimization of antifungal potential of Bacillus strains”, International Journal of Advanced Research (1), pp – [40] Wang Z W., Liu X L (2008), “Medium optimization for antifungal active substances production from a newly isolated Paenibacillus sp using response surface methodology” , Bioresource Technology, 99: 8245 – 8251 [41] WYETH – AYERST (2002), Anti- Infective Overview [42] WHO (2014), “Antimicrobial resistance Global Report on Surveilance”, pp.10 – 24 [43] Zhang T., Shi Z Q., Hu L B., Cheng L G., Wang F (2008), “Antifungal compounds from Bacillus subtilis B – FS06 inhibiting the growth of Aspergillus flavus”, World Journal of Microbiology and Biotechnology 24(6), pp 783 – 788 [44] Zinniel D., Lambrecht P., Harris N., Feng Z., Kuczmarski D., Higley P., Ishmaru C., Arunakumari A., Barletta R., Vidaver A (2002), “Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants”, Applied Environmental Microbiology, 68, pp 2198–2208 Tài liệu Internet: [45] https://www.cdc.gov/mrsa/ [46]Nguyễn Thạnh,(2016)https://www.urmc.rochester.edu/encyclopedia/ content.aspx? contentt ypeid=167&contentid=mrsa culture [47] Thùy Linh, (2017) http://dantri.com.vn/suc-khoe/khang-khang-sinh-o-viet-nam-caonhat-the-gioi-20171113070319572.htm [48]https://baomoi.com/tan-muc-sieu-vi-khuan-dang-so-dang-xam-lan-nhadan/c/13716262.epi 55 PHỤ LỤC MƠI TRƯỜNG – HĨA CHẤT 1.1 THUỐC NHUỘM Crystal violet a) Crystal violet 0,4 g Cồn 96o 10 mL b) Phenol 1g Nước cất 100 mL Lưu ý: trộn hai dung dịch a b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đem lọc Bảo quản chai màu tránh ánh sáng Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300 mL Lưu ý: hòa tan g KI vào mL nước cất, sau thêm g Iod Chờ cho Iod tan hết thêm nước vừa đủ 300 mL Safranin O Safranin O (dung dịch 2% cồn 96o) 25 mL Nước cất 75 mL Lưu ý: Bảo quản chai màu 1.2 MƠI TRƯỜNG Mơi trường NA NB 8g Agar 20 g Nước cất 1000 mL Hấp khử trùng 121oC/ 15 – 20 phút Môi trường NB Cao thịt 5g Peptone bột 10 g NaCl 5g Nước cất 1000 mL pH: 7,4 – 7,6 Môi trường MHA Cao thịt 2g Casein 17,5 g Tinh bột 1,5 g Agar 17 g Nước cất 1000 mL pH 7,3 ± 0,1 Môi trường tối ưu Peptone 7,36g/L Glucose 15g/L CaCO3 0,72g/L MgSO4 0,6g/L PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 2.1 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm khảo sát khả bền hoạt tính kháng khuẩn Bacillus sp RD26 kháng chủng MRSA pH 2.3 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm khảo sát khả bền hoạt tính kháng khuẩn Bacillus sp RD26 kháng chủng MRSA nhiệt độ 2.4 Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm xác định hiệu tách chiết dung môi thông qua vòng kháng khuẩn PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC – MS Mẫu Dịch với Ethanol Mẫu Dịch với Methanol 10 ... ? ?Khảo sát hợp chất kháng Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) từ chủng Bacillus sp RD26 phân lập từ Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum Et thonn)? ??, nghiên cứu này, sử dụng chủng. .. nhiều kháng khuẩn cao Mục tiêu đề tài: Khảo sát hợp chất kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) từ chủng Bacillus sp RD26 phân lập từ Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum. .. chủng Bacillus sp RD26 phân lập từ Diệp Hạ Châu Đắng Bacillus sp RD26 thừa kế từ cơng trình nghiên cứu trước Chúng tơi nghiên cứu đánh giá khả kháng MRSA tối ưu hóa mơi trường để sinh hợp chất