Ở Việt Nam có hệ thực vật đa dạng và phong phú, chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học. Ngày nay, trong nền y học thế giới nói chung, xu hướng sử dụng các sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc thực vật để phòng và trị bệnh đang trở nên phổ biến và có hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu tự nhiên vì tính an toàn, có thể sử dụng lâu dài, hạn chế tác dụng phụ khi sử dụng thuốc tổng hợp hóa học. Dựa trên các nghiên cứu khoa học và kinh nghiệm dân gian, “ Cây Diệp hạ châu đắng” ngày càng được dùng nhiều trong công nghiệp dược. Các nghiên cứu cho thấy hoạt chất phyllanthin và hypophyllanthin có mặt trong thành phần chính của cây Phyllanthus amarus. Các chất này có tác dụng làm gia tăng lượng glutathion là chất bảo vệ và phục hồi tế bào gan. Làm giảm men gan do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B [9]. Vì vậy cây Diệp hạ châu đắng có tác dụng rất tốt để hỗ trợ điều trị viêm gan, viêm gan B, gan nhiễm mỡ, xơ gan, giải độc men gan do uống rượu bia… Với những công dụng thiết thực của cây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) ” để làm rõ 2 mục tiêu sau đây: 1. Tìm hiểu được thành phần hóa học của cây Diệp hạ châu đắng. 2. Tìm hiểu được tác dụng sinh học và hoạt tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus của cây Diệp hạ châu đắng.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUY TÂN KHOA DƯỢC TRANH TÀI GIẢI PHÁP PBL 496 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG ( Phyllanthus amarus ) ĐÀ NẴNG – 2021 TRANH TÀI GIẢI PHÁP PBL 496 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG ( Phyllanthus amarus ) Người hướng dẫn: DS CK II HÀ VĂN THẠNH DS VÕ THỊ BÍCH LIÊN DS PHẠM TIẾN DŨNG Nơi thực hiện: Trường đại học Duy Tân ĐÀ NẴNG – 2021 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đồ án này, thời gian nghiên cứu môn PBL 496 Đặc biệt chúng em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô môn Thực hành Dược khoa Kĩ nghề nhiệt tình hướng dẫn, chỉnh sửa giúp đỡ nhiều q trình làm hồn thành đồ án Cuối xin cảm ơn thành viên nhóm đóng góp ý kiến cơng sức để hoàn thành đồ án Mặc dù cố gắng nhiều đồ án không tránh khỏi sai sót, nhóm chúng em mong nhận thơng cảm ý kiến đóng góp quý thầy cô bạn Đà Nẵng, ngày 25 tháng năm 2021 Người thực hiện: Nhóm 12 - PHM 496 B MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ DANH MỤC ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan thực vật học 1.1.1 Vi tri phân loại chi/loài 1.1.2 Giới thiệu loài 1.2 Thành phần hóa học 1.2.1 Lignan 1.2.2 Alcaloid 1.2.3 Tanin 1.2.4 Flavonoid 1.2.5 Saponin 1.2.6 Các chất khác 1.3 Hoạt tinh sinh học công dụng Diệp hạ châu đắng 1.3.1 Hoạt tinh sinh học 1.3.2 Công dụng 1.4 Một số cơng trình nghiên cứu Diệp hạ châu CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Thời gian đối tượng nghiên cứu 10 2.2 Phương pháp nghiên cứu Diệp hạ châu đắng 10 2.2.1 Đinh tinh 10 2.2.2 Đinh lượng Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 12 2.2.3 Phương pháp đinh lượng phyllanthin 13 2.3 Các phương pháp xác đinh hoạt tinh sinh học Diệp hạ châu đắng 16 2.3.1 Phương pháp thử hoạt tinh kháng khuẩn Diệp hạ châu đắng 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1 Khảo sát thành phần hóa học 20 3.1.1 Kết đinh tinh 20 3.1.2 Thử tinh khiết 21 3.1.3 Khảo sát dung môi chiết 21 3.1.4 Khảo sát phương pháp chiết 22 3.1.5 Khảo sát lần chiết 23 3.1.6 Khảo sát tỉ lệ dung môi 24 3.1.7 Khảo sát tốc độ dòng 26 3.1.8 Quy trình chiết phyllanthin từ P amarus 27 3.1.9 Xây dựng quy trình đinh lượng phyllathin 29 3.1.10 Đinh lượng loài thuộc chi Phyllanthus thu thập .36 3.1.11 Quy trình đinh lượng lignan từ P amarus 37 3.2 Kết thử hoạt tinh kháng khuẩn Diệp hạ châu đắng 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt As Hệ số kéo BĐM Bình đinh mức EA Etyl axetat HPLC High Pressure Liquid Chromatography HP-TLC CH₃COOC₂H₅ Sắc ký lỏng hiệu cao High Pressure- Thin Layer Phương pháp sắc ký lớp mỏng Chromatography hiệu cao K’ Hệ số dung lượng MBC Minimum Bactericidal Concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ kiềm khuẩn tối thiểu N Số đĩa lý thuyết P amarus Phyllanthus amarus Cây Diệp hạ châu đắng P urinaria Phyllanthus urinaria Diệp hạ châu ngọt PDA Photo Diod Array Detector Đầu dò PE Petroleum ether Ete dầu hỏa RSD % Độ lệch chuẩn tương đối S Diện tich đỉnh SD Độ lệch chuẩn SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn TB Trung bình tR Thời gian lưu DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Bảng 3.1 Tên bảng Trang Bảng đinh tinh phận chiết xuất 20 thành công với dung môi Bảng 3.2 Bảng số liệu đinh lượng ( đơn vi mg/g ) 21 Bảng 3.3 Kết thử tinh khiết loài Diệp hạ châu 21 Bảng 3.5 Kết so sánh phương pháp chiết 23 Bảng 3.12 Tương quan nồng độ diện tich đỉnh 29 Bảng 3.14 Kết độ lặp lại 30 Bảng 3.15 Kết khảo sát cách thêm chuẩn 31 Bảng 3.16 Kết khảo sát cách hòa tan lọc 32 Bảng 3.17 Kết khảo sát độ 33 Bảng 3.18 Tinh tương thich hệ thống chuẩn 34 Bảng 3.19 Kết khảo sát tinh tương thich hệ thống mẫu thử 35 Bảng 3.24 Đường kinh vùng ức chế hai loại dich chiết 39 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ DANH MỤC ĐỒ THỊ Danh mục hình ảnh Số hiệu hình Tên hình Trang Hình 1.1 Cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) Hình 2.1 Sơ đồ Chiết xuất dược liệu alcaloid 11 Hình 2.2 Cấu tạo máy HPLC 13 Hình 3.7 Sắc ký đồ hệ MeOH:H2O (30:70) 24 Hình 3.8 Sắc ký đồ hệ MeOH:H2O (33:67) 25 Hình 3.9 Sắc ký đồ hệ MeOH:H2O (35:65) 25 Hình 3.10 Sắc ký đồ tốc độ dòng khác nhau: (-): 1ml/phút; (-): 0,7ml/phút; (-): 0,8ml/phút; (-): 0,9ml/phút 26 Hình 3.11 Sơ đồ quy trình chiết xuất phyllanthin từ P amarus 28 Hình 3.8 Sắc ký đồ hệ MeOH:H2O (35:65) 31 Hình 3.20 Sắc ký đồ 3D P amarus 36 Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu P amarus 36 Hình 3.22 Sắc ký đồ mẫu P sp 37 Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu P urinaria 37 Hình 3.25 Khả kháng Vibrio parahaemolyticus P.amarus khơ 39 Hình 3.26 Khả kháng Vibrio parahaemolyticus P.amarus tươi 40 Danh mục đồ thị Số hiệu đồ thị Tên đồ thị Trang Biểu đồ 3.4 Sự thay đổi hàm lượng phyllanthin theo dung môi chiết 22 Biểu đồ 3.6 Sự thay đổi hàm lượng phyllanthin theo số lần chiết 30 Biểu đồ 3.13 Đồ thi đường cong chuẩn phyllanthin 29 10 ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam có hệ thực vật đa dạng phong phú, chứa đựng nguồn lợi lớn đa dạng sinh học Ngày nay, y học giới nói chung, xu hướng sử dụng sản phẩm thuốc thực phẩm chức có nguồn gốc thực vật để phịng tri bệnh trở nên phở biến có hướng sử dụng sản phẩm có nguồn gốc dược liệu tự nhiên tinh an tồn, sử dụng lâu dài, hạn chế tác dụng phụ sử dụng thuốc tởng hợp hóa học Dựa nghiên cứu khoa học kinh nghiệm dân gian, “ Cây Diệp hạ châu đắng” ngày dùng nhiều công nghiệp dược Các nghiên cứu cho thấy hoạt chất phyllanthin hypophyllanthin có mặt thành phần chinh Phyllanthus amarus Các chất có tác dụng làm gia tăng lượng glutathion chất bảo vệ phục hồi tế bào gan Làm giảm men gan ức chế men ADN polymerase virus viêm gan B [9] Vì Diệp hạ châu đắng có tác dụng tốt để hỗ trợ điều tri viêm gan, viêm gan B, gan nhiễm mỡ, xơ gan, giải độc men gan uống rượu bia… Với công dụng thiết thực cây, tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính sinh học Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) ” để làm rõ mục tiêu sau đây: Tìm hiểu thành phần hóa học Diệp hạ châu đắng Tìm hiểu tác dụng sinh học hoạt tinh kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus Diệp hạ châu đắng ... Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính sinh học Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) ” để làm rõ mục tiêu sau đây: Tìm hiểu thành phần hóa học Diệp hạ châu đắng Tìm hiểu tác dụng sinh học hoạt. .. brevifolincarboxylat 1.3 Hoạt tính sinh học cơng dụng Diệp hạ châu đắng 1.3.1 Hoạt tinh sinh học [22] Các hợp chất chiết từ loài Diệp hạ châu đắng (P amarus), Diệp hạ châu thân đỏ (P urinaria) có hoạt tinh... GIẢI PHÁP PBL 496 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG ( Phyllanthus amarus ) Người hướng dẫn: DS CK II HÀ VĂN THẠNH DS VÕ THỊ BÍCH LIÊN DS PHẠM TIẾN DŨNG Nơi