Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy chủng bacillus nt68 nâng cao hoạt tính enzym phân giải huyết khối nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN CẤP TRƯỜNG TỐI ƯU HỐ MƠI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG BACILLUS NT68 NÂNG CAO HOẠT TÍNH ENZYM PHÂN GIẢI HUYẾT KHỐI Mã số đề tài:…………………………… Thuộc nhóm ngành khoa học: Cơng nghệ hố sinh Bình Dương, 22 tháng 04 năm 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN CẤP TRƯỜNG TỐI ƯU HỐ MƠI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NI CẤY CHỦNG BACILLUS NT68 NÂNG CAO HOẠT TÍNH ENZYM PHÂN GIẢI HUYẾT KHỐI Mã số đề tài:…………………… Thuộc nhóm ngành khoa học: Cơng nghệ hố sinh Sinh viên thực hiện: Đoàn Việt Phi Nam, Nữ: Nam Phạm Thị Ngọc Giàu Võ Thị Thuỳ Ngân Võ Ngọc Yến Nhi Hồ Thị Bích Liên Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: SH09A3, khoa Công nghệ sinh học Năm thứ: 4/4 Số năm đào tạo: Ngành học: Công nghệ sinh học Người hướng dẫn: ThS Dương Nhật Linh Bình Dương, 22 tháng 04 năm 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN: Ảnh 4x6 Họ tên: Đoàn Việt Phi Sinh ngày: 23 tháng 12 năm 1991 Nơi sinh: Tp HCM Lớp: SH09A3 Khóa: 2009 - 2013 Khoa: Cơng nghệ sinh học Địa liên hệ: B4/ 100, ấp 2, xã Đa Phước, huyện Bình Chánh, Tp HCM Điện thoại: 01212229352 Email: vietphi2312@gmail.com II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP: * Năm thứ 1: Ngành học: Công nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học Kết xếp loại học tập: Giỏi Sơ lược thành tích: * Năm thứ 2: Ngành học: Công nghệ sinh học Kết xếp loại học tập: Khá Khoa: Cơng nghệ sinh học Sơ lược thành tích: * Năm thứ 3: Ngành học: Công nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: Tham gia nghiên cứu khoa học cấp trường đạt Giải khuyến khích * Năm thứ 4: Ngành học: Công nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: Ngày 22 tháng 04 năm 2013 Xác nhận đơn vị (ký tên đóng dấu) Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: TỐI ƯU HỐ MƠI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NI CẤY CHỦNG BACILLUS NT68 NÂNG CAO HOẠT TÍNH ENZYM PHÂN GIẢI HUYẾT KHỐI - Sinh viên thực hiện: Đoàn Việt Phi Phạm Thị Ngọc Giàu Võ Thị Thuỳ Ngân Võ Ngọc Yến Nhi Hồ Thị Bích Liên - Lớp: SH09A3 Khoa: Công nghệ sinh học Năm thứ: Số năm đào tạo: - Người hướng dẫn: ThS Dương Nhật Linh Mục tiêu đề tài: - Xác định môi trường điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng Bacillus NT68 nhằm nâng cao hoạt tính enzym phân giải huyết khối Tính sáng tạo: - Tất nội dung kết nghiên cứu có tính Hiện số ca tử vong bệnh liên quan đến tim mạch ngày tăng, liệu pháp điều trị bệnh tim mạch mang lại hiệu khơng mong muốn, mối nguy hại việc xuất huyết đường tiêu hóa giá thành đắt, thúc đẩy việc nghiên cứu nhằm tìm nguồn enzym kinh tế an tồn Bởi vậy, enzym phân giải huyết khối từ vi sinh vật thu hút nhiều mối quan tâm y học, nhiên điều kiện nuôi cấy môi trường dinh dưỡng thu enzym có hoạt tính khơng cao, việc tối ưu hố thành phần điều kiện nuôi cấy nhằm thu enzym có hoạt tính cao để làm tiền đề cho nghiên cứu nhằm tạo nguồn enzym phân giải huyết khối từ vi sinh vật đem lại liệu pháp điều trị bệnh liên quan đến tim mạch, giá thành rẻ an toàn người bệnh - Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp tối ưu hoá quy hoạch thực nghiệm Phương pháp có nhiều ưu điểm so với phương pháp tối ưu hoá khác như: giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết; hàm lượng thông tin nhiều rõ rệt, nhờ đánh giá vai trò qua lại yếu tố ảnh hưởng chúng đến hàm mục tiêu, nhận mô hình tốn học thống kê thực nghiệm theo tiêu chuẩn thống kê, đánh giá sai số trình thực nghiệm theo tiêu chuẩn thống kê cho phép xét ảnh hưởng yếu tố với mức độ tin cậy cần thiết; cho phép xác định điều kiện tối ưu đa yếu tố đối tượng nghiên cứu cách xác cơng cụ tốn học, thay cho cách giải gần đúng, tìm tối ưu cục thực nghiệm thụ động - Tóm lại nghiên cứu nguồn enzym phân giải huyết khối từ vi sinh vật thay cho loại thuốc phân giải huyết khối (giá thành đắt gây nhiều tác dụng phụ) góp phần khơng nhỏ việc điều trị bệnh liên quan đến tim mạch, đặc biệt bệnh đột quỵ nghẽn mạch máu, bệnh gây tử vong hàng đầu giới Kết nghiên cứu: Đề tài đạt mục tiêu đề thu kết sau: - Từ 53 chủng vi khuẩn thử nghiệm tiến hành thử nghiệm khả tiêu huyết, định tính xác định hoạt tính enzym phân giải huyết khối, thu chủng NT68 có hoạt tính enzyme phân giải huyết khối mạnh (14,71 FU/ mL) sau thời gian nuôi cấy 48h - Kết định danh sinh hoá chủng NT68 cho thấy chủng Bacillus subtilis - Kết điện di gel agarose, sản phẩm PCR thu có kích thước phân tử khoảng 1,5 kb - Sau trình tự hiệu chỉnh phần mềm ChromasPro 1.7.4, gióng cột phần mềm Clustal X so sánh với sở liệu GenBank, kết luận chủng NT68 chủng Bacillus subtilis - Xác định tương quan tuyến tính OD610 mật độ tế bào theo phương trình y = 3,62x + 7,584 với độ tin cậy 99,52% - Xác định 36h thời điểm thích hợp để kết thúc trình lên men thu nhận enzym phân giải huyết khối với hoạt tính 14,86 FU/mL - Lựa chọn ba ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính enzym phân giải huyết khối Al3+, Na+, K+ nồng độ khảo sát 5mM - Xác định yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym phân giải huyết khối nhiệt độ, pH, Al3+, Na+ thiết kế thí nghiệm dạng đầy đủ theo phương trình hồi quy Y = -1,6 – 0,136X1 + 3,65X2 – 0,475X3 + 0.439X4 + 0,064X5 với độ tin cậy 99,01% - Kết thí nghiệm khởi đầu thu hàm mục tiêu lân cận vùng cực trị theo phương trình hồi quy Y = 17,2 - 0,151X1 + 0,592X2 - 0,196X3 + 0,431X4 với độ tin cậy 99,20% - Kết thí nghiệm bề mặt tiêu thu hàm mục tiêu theo phương trình hồi quy Y= 23,31 – 3,3562X1 + 1,9312X2 – 0,2738X3 + 2,3063X4 – 2,6438X12 – 3,1388X22 + 0,4613X32 +2,295X42 + 1,4737X1X2 + 8,8088X1X3 + 3,3862X1X4 2,925X2X3 -0,7425X2X4 – 1,53X3X4 với độ tinh cậy 99,73% - Xác định giá trị tối ưu yếu tố theo thiết kế Box – Behnken là: nhiệt độ: 30oC, pH: 7,7, Al3+: 1mM, Na+: 10mM - Kết lên men thử nghiệm xác định hoạt tính enzym phân giải huyết khối 36,55 FU/ mL (tương ứng với dự đoán 36,8662 FU/ mL) Điều chứng tỏ giá trị tối ưu yếu tố phù hợp với thực nghiệm Kết cho thấy sau trình tối ưu hố hoạt tính enzym phân giải huyết khối nâng cao rõ rệt, cao gấp 2,5 lần so với hoạt tính ban đầu (từ 14,71 FU/ mL tăng lên 36,55 FU/ mL) Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài: - Thành công nghiên cứu tiền đề cho việc thu nhận tinh enzym phân giải huyết khối, đem lại liệu pháp điều trị bệnh liên quan đến tim mạch, giá thành rẻ an toàn người bệnh Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài (ghi rõ tên tạp chí có) nhận xét, đánh giá sở áp dụng kết nghiên cứu (nếu có): Ngày 22 tháng 04 năm 2013 Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài: - Đề tài có tính sáng tạo, kết nghiên cứu đạt độ tin cậy cao - Đề tài viết số báo đăng tạp chí sinh học hội nghị nghiên cứu khoa học - Đề tài sử dụng phương pháp tối ưu hoá quy hoạch thực nghiệm, phương pháp có nhiều ưu điểm so với phương pháp tối ưu đơn yếu tố: giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết; hàm lượng thơng tin nhiều rõ rệt, nhờ đánh giá vai trò qua lại yếu tố ảnh hưởng chúng đến hàm mục tiêu, nhận mơ hình tốn học thống kê thực nghiệm theo tiêu chuẩn thống kê, đánh giá sai số trình thực nghiệm theo tiêu chuẩn thống kê cho phép xét ảnh hưởng yếu tố với mức độ tin cậy cần thiết; cho phép xác định điều kiện tối ưu đa yếu tố đối tượng nghiên cứu cách xác cơng cụ tốn học, thay cho cách giải gần đúng, tìm tối ưu cục thực nghiệm thụ động - Từ kết nghiên cứu làm tiền đề cho bước nghiên cứu nhằm tạo nguồn enzym phân giải huyết khối rẻ tiền, an toàn cho người bệnh - Kết nghiên cứu cung cấp thêm sở khoa học vai trò ứng dụng ngày cao enzym phân giải huyết khối từ vi sinh vật Ngày 22 tháng 04 năm 2013 Xác nhận đơn vị Người hướng dẫn (ký tên đóng dấu) (ký, họ tên) PHỤ LỤC 5.8 Kết u xử lý thốn k ANOVA yếu tố kết u xếp hạn củ thí n hiệm xác ịnh h ạt tính enzym phân i i huyết khối (FU/ mL) the thời i n bằn phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0 PHỤ LỤC 5.9 Kết u xử lý thốn k ANOVA yếu tố kết u xếp hạn củ thí n hiệm chọn l i n kim l ại nh hưởn ến h ạt tính enzyme phân i i huyết khối bằn phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0 5.10 Kết u xử lý thốn k ANOVA yếu tố h ạt tính enzym phân i i huyết khối củ thử n hiệm bằn phần mềm Mic s ft Excel Anova: Single Factor SUMMARY Standard Groups Count Sum Average Variance 9,217 3,07233 0,00185 Error 0,024835 PHỤ LỤC TH 2.3.1 3,24167 1,08056 0,00015 0,006998 TH 4.4 1,235 0,41167 1,2E-05 0,002027 279 5,375 1,79167 4,9E-05 0,004055 99 2,147 0,71567 4,4E-05 0,003844 128 5,334 1,778 0,00048 0,012662 133 4,607 1,53567 0,00025 0,009602 4,575 1,525 3,1E-05 0,003215 69 10,82 3,60667 0,00016 0,007219 64 6,20323 2,06774 0,00042 0,011799 7,804 2,60133 5,6E-05 0,004333 9,193 3,06433 0,00117 0,019743 11,879 3,95967 0,00023 0,008743 3,4152 0,00026 0,009537 C4.2 TH 4.6 71 TH 1.2 66 43 11,888 3,96267 0,00154 0,022674 11,214 3,73801 0,08319 0,166526 13,909 4,63633 1,7E-05 0,002404 12,1969 4,06562 0,01125 0,061241 4,519 0,00018 0,00781 TB 1.3 98 NT 182 10,2456 13,557 TB 1.5 14,1754 4,72515 0,05168 0,131245 TB 3.7 14,077 4,69233 1,6E-05 0,002333 131 15,705 5,235 0,00166 0,023544 273 17,558 5,85267 1,6E-05 0,002333 44 13,277 4,42567 0,00011 0,006173 153 18,204 6,068 0,00578 0,043879 19,1158 6,37193 0,26238 0,295738 19,425 6,47499 0,00665 0,047068 23,298 7,766 0,00102 0,018475 20,183 6,72767 4,3E-06 0,001202 23,593 7,86433 1,7E-05 0,002404 23,775 0,00116 0,019698 TH 3.1 97 TB 2.1 163 NT3 7,925 PHỤ LỤC C4.4 23,986 7,99533 7,2E-05 0,00491 C3.8 23,6632 7,88772 0,04669 0,124747 TH 3.3 22,259 7,41967 0,00014 0,006936 TH 4.11 24,6175 8,20585 0,01681 0,074854 25.008 8,336 9E-06 0,001732 155 25,207 8,40234 0,01267 0,064994 36 24,5327 8,17756 0,01318 0,066284 152 26,358 8,786 0,00848 0,053163 29,362 9,78733 0,00026 0,009262 31,48 10,4933 1,3E-06 0,000667 213 28,8281 9,60936 0,18799 0,250325 29,864 9,95467 0,00124 0,020333 67 29,7404 9,91345 0,0107 0,059729 122 30,1187 10,0396 0,05967 0,141028 39 30,007 10,0023 3,6E-05 0,00348 37 31,326 10,442 0,03133 0,102196 134 36,294 12,098 0,00868 0,053799 40 36,772 12,2573 1,2E-05 0,002028 33 40,548 13,516 7,9E-05 0,005132 68 44,1304 14,7101 0,02884 0,098048 5,501 1,83367 0,0025 0,028869 10 20,2104 6,73678 0,03686 0,110846 C3.3 C2.2 ANOVA Source of Variation SS df MS Between Groups 1937,38 52 37,2573 Within Groups 1,79618 106 0,01695 Total 1939,18 158 F 2198,7 P-value F crit 2,8804E-141 1,46409 PHỤ LỤC 5.11 Kết u xử lý thốn k ANOVA yếu tố củ thí n hiệm xây d ng ườn chuẩn Ty sine Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Averag Varianc Standard e e Error 0 0 0.2 0.818 0.2727 6.5E-05 0.004667 0.4 1.704 0.568 0.00038 0.011269 0.6 2.656 0.8853 0.00107 0.018853 0.8 3.172 1.0573 0.00106 0.018765 3.987 1.329 0.00112 0.019348 df MS F 0.7479 1215.37 12 0.0006 ANOVA Source of Variation Between Groups SS 3.7393 P-value F crit 8.57021E-16 3.1059 0.0073 Within Groups 3.7466 Total 5.12 17 Kết u xử lý thốn k ANOVA yếu tố củ thí n hiệm chọn l i n kim l ại nh hưởn ến h ạt tính enzyme phân i i huyết khối bằn phần mềm Mic s ft Excel Anova: Single Factor PHỤ LỤC SUMMARY Standard Groups Count Sum Average Variance Error Ca 31,242 10,414 0,047101 0,125301 Co 9,0533 3,01775 0,01346 0,066982 Fe3+ 8,968 2,98933 0,001616 0,023212 Mg 32,126 10,7088 0,114054 0,194982 Na 59,537 19,8457 0,035142 0,108232 Hg 0,5895 0,19649 0,000591 0,014035 Mn 3,158 1,05267 0,000996 0,018224 Fe2+ 11,538 3,84586 0,003517 0,034239 Ba 33,516 11,1719 0,046685 0,124747 Zn 36,421 12,1404 0,099871 0,182456 Cu 19,916 6,63867 0,154142 0,226673 Al 52,624 17,5414 0,05046 0,129692 K 48,799 16,2663 0,015762 0,072485 df MS F 2827,157 ANOVA Source of Variation SS Between Groups 1522,48 12 126,874 1,1668 26 0,04488 1523,65 38 Within Groups Total 5.13 P-value F crit 2,65925E-37 2,1479 Kết u xử lý thốn k ANOVA yếu tố củ thí n hiệm xác ịnh mật ộ tế bà the thời i n bằn phần mềm Mic s ft Excel Anova: Single Factor SUMMARY PHỤ LỤC Standard Groups Count Sum Average Variance Error 0h 24 0 6h 33,06 11,02 0,0013 0,020817 12h 37,19 12,3967 0,00253 0,029059 18h 38,48 12,8267 0,00093 0,017638 24h 39,44 13,1467 3,3E-05 0,003333 30h 40,57 13,5233 0,00093 0,017638 36h 42,17 14,0567 3,3E-05 0,003333 42h 13,5 0,0007 0,015275 48h 39,38 13,1267 0,00813 0,052068 54h 38,84 12,9467 0,00123 0,020276 60h 38,43 12,81 0,0012 0,02 66h 38,19 12,73 0,0004 0,011547 72h 37,83 12,61 0,0016 0,023044 40,5 ANOVA Source of Variation SS Df MS Between Groups 84,5905 12 7,04921 Within Groups 0,03807 26 0,00146 Total 84,6286 38 5.14 F 4814,7 P-value 2,63836E-40 Kết u xử lý thốn k ANOVA yếu tố h ạt tính protease theo thời i n bằn phần mềm Mic s ft Excel Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Standard PHỤ LỤC Error 0h 0,147 0,049 4E-06 0,001155 6h 0,277 0,09233 3,3E-07 0,000333 12h 0,568 0,18933 1,2E-05 0,002028 18h 0,826 0,27533 3,3E-07 0,000333 24h 1,087 0,36233 3E-05 0,00318 30h 1,152 0,384 4E-06 0,001155 36h 1,246 0,41533 3,3E-07 0,000333 42h 1,099 0,36633 3,3E-07 0,000333 48h 1,07 0,35667 6,3E-06 0,001453 54h 0,997 0,33233 3,3E-07 0,000333 60h 0,862 0,28733 6,3E-06 0,001453 66h 0,844 0,28133 3,3E-07 0,000333 72h 0,789 4E-06 0,001155 0,263 ANOVA Source of Variation SS df MS Between Groups 0,4474 12 0,03728 Within Groups 0,0001 26 5,3E-06 Total 0,4475 38 5.15 F 6990,46 P-value F crit 2,07599E-42 2,1479 Kết u xử lý thốn k ANOVA yếu tố củ thí n hiệm xác ịnh h ạt tính enzym phân i i huyết khối the thời i n bằn phần mềm Microsoft Excel Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Averag Varianc Standard PHỤ LỤC e e Error 0h 0 0 6h 10,485 3,495 2,8E-05 0,003055 12h 20,463 6,821 3,1E-05 0,003215 18h 29,178 9,726 0,00012 0,006245 24h 39,15 13,05 0,0043 0,037859 30h 40,53 13,51 0,0012 0,02 36h 44,58 14,86 0,0028 0,030551 42h 39,42 13,14 0,0121 0,063509 48h 38,25 12,75 0,0052 0,041633 54h 35,73 11,91 0,0012 0,02 60h 30,57 10,19 0,0028 0,030551 66h 29,433 9,811 7,9E-05 0,005132 72h 27,069 9,023 7E-06 0,001528 ANOVA Source of Variation SS df MS F 12 54,902 23900,9 26 0,0023 P-value F crit 658,82 Between Groups 0,0597 Within Groups 658,88 Total 38 2,38833E-49 2,1479 PHỤ LỤC 5.16 Kết u phân tích m hình h i uy thí n hiệm ầy ủ PHỤ LỤC 5.17 Kết u phân tích phươn s i thí n hiệm ầy ủ PHỤ LỤC 5.18 Kết u phân tích m hình h i uy thí n hiệm khởi ầu PHỤ LỤC 5.19 Kết u phân tích phươn s i thí n hiệm khởi ầu PHỤ LỤC 5.20 Kết u phân tích m hình h i uy thí n hiệm bề mặt ti u PHỤ LỤC 5.21 Kết u phân tích phươn s i thí n hiệm bề mặt ti u ... tài: - Xác định môi trường điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng Bacillus NT68 nhằm nâng cao hoạt tính enzym phân giải huyết khối Tính sáng tạo: - Tất nội dung kết nghiên cứu có tính Hiện số ca... Chọn lựa ion kim loại ảnh hưởng đến hoạt tính enzym phân giải huyết khối - Tối ưu hóa điều kiện mơi trường nâng cao hoạt tính enzym phân giải huyết khối từ chủng lựa chọn thiết kế thí nghiệm dạng... NT68 nâng cao hoạt tính enzym phân giải huyết khối " N i ung đề tài - Tái sàng lọc chủng vi khuẩn có khả sinh enzym phân giải huyết khối - Định tính khả sinh enzym phân giải huyết khối môi trường