TRUONG DAI HOC SU PHAM HA NỘI II KHOA SINH - KTNN
đt tự cất ất [_[ | t St tặc
ĐÀO THỊ NỮ
TUYỂN CHỌN, TỐI ƯU HĨA MƠI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHO CHỦNG ACETOBACTER XYLINUM,
CHẾ TẠO MÀNG SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh học
Trang 2LỜI CÁM ƠN
Trong q trình hồn thành đề tài này, em đã nhận được sự giúp đỡ chỉ bao tận tình của các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Vi sinh khoa Sinh - KTNN
Trường ĐHSP Hà Nội 2, sự giúp đỡ động viên của gia đình, bạn bè Em xin
trân trọng gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Khắc Thanh và PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung các thầy cô là những người đã cung cấp cho em những kiến thức, những hướng đi đúng trong quá trình nghiên cứu Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung, cô không chỉ hướng dẫn chỉ bảo em một cách tận tình mà còn cung cấp cho em những tài liệu giá trị để em có hướng đi đúng đắn trong quá trình nghiên cứu, hồn thành đề tài Đồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị trong phòng Vi sinh Khoa Sinh - KTNN Trường DHSP Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất, không chỉ về cơ sở vật chất mà còn cả sự động viên, khuyến khích em hồn thành đề tài này
Do thời gian nghiên cứu còn hạn chế, đề tài của em không tránh khỏi sai sot, rất mong sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 04 năm 2008
Sinh viên thực hiện
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự that Tat
cả những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua sử lí thống kê, hồn tồn khơng có số liệu sao chép, bịa đặt và không trùng với bat ctr tai liệu nao.Trong đề tài của tơi có trích dẫn một số dẫn liệu của một số tác giả khác
Trang 4MỤC LỤC Danh mục hình và bảng biểu
DAT VAN DE
NOI DUNG
Chương 1: Téng quan tài liệu
1.1 Luge str nghién ctru vi khuan Acetobacter
1.2 Phân loai vi khuan Acetobacter
1.3 Dac diém chung ctia vi khuan Acetobacter Chuong 2: Nguyén liéu va phuong phap 2.1 Nguyên liệu
2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh 2.2.2 Phương pháp toán học
2.2.3 Phuong phap tao ché pham mang sinh hoc cellulose tir A.xylinum Chương 3: Kết quả nghiên cứu
3.1 Tuyến chọn vi khuẩn Acetobacter tir một số nguồn nguyên liệu 3.2 Tuyén chon ching Acetobacter xylinum thuan khiét
3.3 Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học 3.4 Nghiên cứu động thái phát triển cua ching A.xylinum Dj; 3.5 Khảo sát sự thay đổi pH trong môi trường nuôi cấy của Dị; 3.6 Khảo sát khả năng tạo màng của D¡; ở các môi trường nuôi cấy khác nhau
3.7 Tối wu hoa kha nang tao mang cua ching A.xylinum D); 3.8 Xử lý màng BC và bước đầu dùng màng đề đắp lên vết thương
hở ở thỏ
KET LUAN
TAI LIEU THAM KHAO
Trang 5DANH MUC HINH BANG BIEU HINH Hinh 3.1 Hinh 3.2 Hinh 3.3 Hinh 3.4 Hinh 3.5 Hinh 3.6 Hinh 3.7 ODato- Hinh 3.8 Hinh 3.9
Đồ thị diễn hàm lượng axIt axetic của một số chung Acetobacter Anh khuan lac ching Acetobacter xylinum D3
Vòng phân giải CaCO; của chủng D,3
Màng BC của chủng Da, Tế bào D;; nhuộm Gram
Tế bào D¡; nhuộm I; và H;SO,
Đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào của chủng Dị; với giá trị Đề thị sinh trưởng của chủng D›;,
Đồ thị biểu dién sự thay đổi hàm lượng axit axetic trong dịch nuôi cấy theo thời gian của chủng Da,
Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương ở thỏ
Hình 3.11 Tiến trình lành vết thương ở thỏ BANG Bang 1.1 Bang 3.1 Bang 3.2 Bang 3.3 Bang 3.4 Bang 3.5 Bang 3.6 Bang 3.7 Bang 3.8 Bang 3.9
Các đặc điểm phan biét Acetobacter và Gluconobacter
Hàm lượng axit axetic cla mét sé ching Acetobacter
Dac diém sinh hoc cua ching vi khudn Acetobacter xylinum
Thoi gian nudi cấy, số lượng tế bào, giá trị OD,¡o của chủng D::
Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trường khác nhau Các yếu tố và mức khảo sát của chủng D:;
Ma trận thực nghiệm của chủng D;;
Mô hình thực nghiệm của chủng D;
Lược đồ tối ưu hoá điều kiện nuôi cay cua chủng D:;
Các yếu tố và mức khảo sát
Trang 6Bảng 3.11 Mơ hình thực nghiệm của chủng D:;
Bảng 3.12 Lược đồ tối ưu hố mơi trường ni cấy của chủng D;; Bảng 3.13 Các bước xử lý màng BC
Trang 7ĐẶT VAN DE
Trong tự nhiên ngoài thực vật có khả năng tổng hợp màng cellulose cịn có rất nhiều loài vi khuẩn có khả năng sản sinh ra màng cellulose gọi là màng
sinh hoc hay Bacterial Cellulose (BC), đặc biệt là các loài Acetobacter điển
hinh la chung Acetobacter xylinum Khi nudi cay Acetobacter xylinum trên môi trường dịch lỏng, trong điều kiện ni cấy tĩnh sẽ hình thành nên một lớp màng, màng đó có bản chất là cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn [1] Do vay, mang BC vừa có cấu trúc và đặc tính cơ học rất giống với
cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hố lý đặc biệt như: độ bền cơ học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng
thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hoá lớn [12] [13]
Màng BC có nhiều đặc tính hố ly ưu việt nên nó được xem như là một
nguồn polymer sinh học mới và đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: ngành công nghiệp thực phâm sản xuất thạch đừa, là nguyên liệu tốt nhất của công nghiệp sản xuất giấy chất lượng cao, làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bảo
năng lượng, sử dụng như là một nhân tố để biến đổi độ nhớt, làm các sợi
truyền quang, là môi trường cơ chất trong sinh học sử dụng để cố định protein
hay cho sắc kí, làm màng nối mạch máu và màng thâm tách [11] [17] Các
nhà khoa học khi nghiên cứu những tính năng đặc biệt như: bám chắc trên bề mặt ngay khi nước bốc hơi, không cho nước lỏng thắm qua nhưng lại cho hơi nước di chuyên, có khá năng ngăn cản vi khuẩn, thay thế đa tạm thời Vì vậy, màng BC được coi là nguyên liệu trong y học dùng để làm da nhân tạo
[12]
Trang 8tang, dé lai di chứng đến khả năng vận động, thâm mỹ và sức khoẻ của người bệnh Ở Việt Nam riêng viện bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận khoảng 400 ca bỏng Hiện nay, nguời ta đã có nhiều dược phẩm dùng đề điều trị bỏng như: Madecassol, Polymethan hay các chế phẩm sinh học như: màng
da ếch, màng ỗi, da lợn đã được chứng minh là có hiệu quả tốt [7] [8]
Nhưng sử dụng các chế phẩm trên đều có hạn chế như: thời gian điều trị đài ngày, chỉ phí cao, khơng ngăn được sự xâm nhập của vi khuẩn, gây đau rát khi sử dụng
Mặt khác đã từ lâu trong lịch sử y học, người ta đã sử dụng dầu mù u
vào việc săn sóc bảo vệ da chống lại các tác nhân gây tốn hại, nó có tác dụng
mạnh trong điều trị đau dây thần kinh, đau khớp xương; là một thuốc kháng viêm đắp tại chỗ rất có hiệu quả; chỉ định rộng rãi cho các vùng viêm tấy có
vết thương; là thuốc đắp tuyệt háo chữa các vết bỏng do kích thích mơ hạt
mọc nhanh, tạo một sẹo da mềm mại Dầu mù u được sử dụng rộng rãi trong
điều trị các bệnh về da [18] [19]
Trang 9NỘI DUNG
CHUONG 1 TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Lược sử nghiên cứu về vi khuẩn 4cefobacfer [1]
Từ rất lâu trong lịch sử, con người đã biết cách làm giấm bằng kinh nghiệm
thực tiễn của mình mặc dù họ chưa hiểu rõ được cơ sở của quá trình tạo giấm,
càng không thể giải thích được bằng cách nào mà từ rượu loãng lại có thé
chuyên thành giấm Cho đến khi khoa học phát triển, đặc biệt với sự ra đời
của kính hiến vi, thế giới vi sinh vật được khám phá thì việc giải thích cơ sở
của quá trình lên men giấm trở nên đơn giản Ngày nay, chúng ta đã khẳng định được rằng tác nhân của quá trình sản xuất giấm ăn là vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn axetic, vi khuẩn giấm)
Những cơng trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn axetic vào năm 1822 của Person Ông nghiên cứu lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt dịch giấm,
sau đó tiễn hành phân lập và thu duoc mét loai vi sinh vat tén la Mycoderma
aceii Đến năm 1837, Kiitzing lam thi nghiém bang cách loại bỏ hết các vi
sinh vật trong các bình giấm thì giấm sẽ khơng được tạo thành Ơng đã đi đến kết luận: quá trình lên men giấm nhất thiết phải có vi sinh vật Cùng năm 1837, nhà bác học nồi tiếng người Đan Mạch là Hansen đã tách được từ màng giấm 2 loại vi khuẩn giấm thuần khiết là: Mycoderma aceti và Mycoderma
pasteurinanum
Những năm 1862 - 1868, Pasteur với sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi, ông đã chứng minh nhận xét của Kiitzing và Hansen là hoàn toàn đúng đắn Pasteur nghiên cứu màng xuất hiện trên bia, rượu vang và khẳng định:
Trang 10Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn 4cefobacter, các nghiên cứu tiếp theo sau này đều nhằm tìm hiểu rõ thêm và cải thiện quá trình lên men giấm Hiện nay, người ta đang đi vào những ứng dụng mới của vi khuẩn Acetobacter bang cach phan lap các chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu các đặc điểm cấu tạo sinh lý, sinh hố nhằm tìm ra những chủng tốt nhất cho từng ứng dụng, trên cơ sở đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại đã được đưa
ra
1.2 Phân loại Acetobacter [1]
1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại 4cefobacfer
Dé phan loai Acetobacter, các tác giả dựa vào các tiêu chuẩn sau đây: - Địa điểm phân lập: có liên quan đến các điều kiện môi trường sống
- Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, đặc tính, tính chất, màu sắc
đặc điểm của khuẩn lạc trên môi trường thạch Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng chú ý sự biến đổi của môi trường sau một thời gian nuôi cấy (môi trường đục hay trong, có mùi thơm dễ chịu hay không mùi, màu sắc môi trường vàng nâu hay vàng nhạt .)
- Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bảo, khả năng di
động, có tiên mao hay không, vỏ nhầy, màu sắc tế bào khi nhuộm Gram
- Các đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố nhiệt độ, pH môi
trường, khả năng hình thành sắc tố, quan hệ với oxi, khả năng lên men axetic, khá năng sử dụng các hợp chất hữu cơ và vô cơ
Ngoài các tiêu chuân cơ bản ở trên, ngày nay khi định loại Acetobacter các tác giả còn sử dụng sinh học phân tử đề giải trình tự rARN16S
1.2.2 Lược sử phân loại Acetobacter
Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter duoc thuc hién tir thé ky
XIX Nam 1898 Rothenback đã tiến hành phân loại, tiép theo la Hoyer
Trang 11Nergey (1948 - 1957), J.Prateur (1950) Trong đó khóa phân loại của Beijerinck (1899) da thu hút sự quan tâm của nhiều tác giả Ông chia vi khuẩn axetic thành 4 nhóm cơ bản Đến năm 1916, Janke kế tiếp những nghiên cứu của Beijerinck, Janke đã phân loại vi khuẩn axetic thành 4 nhóm dựa trên 2 dấu hiệu sau đây:
Một: khả năng sử dụng đạm amoniac giúp cho các giai đoạn sinh trưởng của vi khuẩn Acefobacter
Hai: có hay khơng có giai đoạn di động trong quá trình sinh trưởng và
phát triển
Khi nghiên cứu nơi sinh sống đặc trưng của vi khuẩn axetic, năm 1926 Henenberg đã phân loại chúng thành 4 nhóm sau đây:
- Nhóm l: vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa hublon độc với chúng - Nhóm 2: vi khuân có khả năng phát triển trên bia
- Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung địch rượu vang - Nhóm 4: vi khuẩn để sản xuất giắm theo phương pháp nhanh
Đến năm 1934, các nhà nghiên cứu vi khuẩn học Hoa Kỳ dựa vào khả
năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của C và N nên đã xếp vi
khuẩn axetic vào họ Nitrobacteriaceae Từ đó, vi khuẩn axetic có tên là vi khuẩn Acetobacter Dén nim 1936, cdc tac gia Kenyver, Wanneil, Staniel da
néu y kién ghép vi khuan Acetobacter vao ho vi khuan Pseudomonas vi ching có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động
Đến năm 1948, theo kết quả nghiên cứu của Vanghn: các vi khuẩn Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter zancens, Acetobacter melanoginum, Acetobacter oxydans đều có khả năng đi động
Vanghn lí giải là: các loài trên thuộc cùng một loại có đơn mao ở cực và ông đề
Trang 12Cùng năm 1948, Krassilnicov với nghiên cứu về xạ khuẩn và vi khuẩn,
cùng với một số tác giả người Mỹ trong các bài báo của mình đều thống nhất xép vi khuan Acetobacter vao họ vi khuẩn Pseudomonadaceae
Theo khoá phân loại của Bergeys (1914) và cùng nhiều tác giả khác hiện nay thi vi khudn Acetobacter va Gluconobacter - các vì khuẩn axetic được xếp vào một họ riêng là Acetobacteriaceae Trong khoá phân loại của Bergeys đã phân chia các loai trong giéng Acetobacter thành 2 loại:
Loại 1: oxi hóa axit axetic thành CO; và HạO, bao gồm các nhóm:
a Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch Hoyer) đại diện là: Acetobacter aceti
b Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất
- Trên môi trường dich thé tao thanh mang nhay day cé chtra cellulose
dai dién 1a: Acetobacter xylinum
-Trên môi trường dịch thể không tạo thành màng nhầy có chứa
cellulose: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter
kneiiziganus
Loại 2: khơng oxi hóa axit axetic
* Tạo thành sắc tố nâu trên môi trường glucose
Sắc tố nâu tối tới den nhat : Acetobacter melanogenus Sắc tố hồng : 4cefobacter resens
* Không tạo thành sắc tố
Nhiệt độ thích hợp nhất là khoảng 30 - 35 °C : Acetobacter suboxydans Nhiệt độ thích hợp nhất là 18-21 °C : Acetobacter oxydans
Trang 13Những nghiên cứu về đặc điểm, về phân loại vi khuẩn Acetobacter nay đã tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, đồng thời là cơ sở cho việc ứng dụng các chủng vi khuẩn này vào đời sống thực tiễn ở giai đoạn về sau Hiện nay, người ta đã sử dụng vi khuân giấm một cách rộng rãi trên quy mô công
nghiệp tạo ra rất nhiều sản phẩm có ý nghĩa
1.3 Đặc điểm chung của vi khuẩn 4cefobacfer [I]
Vi khuan Acetobacter la tác nhân chính của q trình lên men axit axetic Căn cứ vào tiêu chuẩn phân loại học có thể xếp chúng vào 2 giống: Acetobacter có chu mao hoặc khơng có chu mao và ŒÏuconobacfer đơn mao
Theo Bergey (1989) va Larpent et al (1990), Acetobacter và Gluconobacter la 2 giéng vi khuẩn axetic quan trọng nhất của họ Acetobateriaceae Hai giống vi khuẩn trên gặp rất nhiều trong tự nhiên như ở trên bề mặt lá cây, hoa quả Cá 2 giống đó đều có khả năng tạo axit axetic từ rượu nhưng trong tế bào GŒ//conobacfer khơng có chu trình ATC (tricacboxylic) nên không thể diễn ra quá trình oxi hóa axetat thay vào đó có một số chu trình khác như chu trình Glyoxilat, q trình photphoril hóa, còn Acetobacter lại xảy ra các quá trình trên
Khi so sánh 2 giống trên với những vi khuẩn thuộc giống Psewdomonas thấy có nhiều nét tương đồng Tuy nhiên chúng cũng khác với Pseudomonas ở những đặc điểm sau: có thể chịu độ axit cao hơn, khả năng chuyển hóa pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di dộng hơn Một số loài vi khuẩn axetic khi sống trên môi trường nghèo dinh dưỡng hay thời gian nuôi cấy lâu
ngày tế bào dễ bị biến đổi hình thái (kéo dài hay phinh to, phân nhánh)[3]
Trang 14năng di động, sống hiếu khí bắt buộc, hóa dưỡng hữu cơ, nhuộm màu Gram
âm, không sinh bào tử
Bảng 1.1 Các đặc điểm phân biệt 4cefobacfer và Gluconobacter ( So sánh với Pseudomonas )
Đặc điểm Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas 1 Vi tri tién mao + +/- Tiên mao ở cực
2 Phát triển ở pH = 4.5 + + —
3 Oxi hóa aceton 6 pH= 4.5 + + _ 4 Oxi hóa axit axetic _ + + 5 Oxi hóa lactat _
6 Glucose > gluconate + +/- +/-
7 Sử dụng tinh bột lactose — _ +/=
8 Str dung gelatin _ _ +/-
9 Sắc tô huỳnh quang — — +/-
Vi khuan Acetobacter thich hop voi pH = 4,2 — 6,8; nhiệt độ thích hợp 25 - 30 °C, có khả năng oxi hóa rượu etylic thanh axit axetic, có q trình oxi hóa hồn tồn các hợp chất hữu cơ (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit hữu cơ tương ứng
1.3.1 Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter [1] [3]
Trên môi trường đặc vi khuẩn axetic phát triển thành các khuẩn lạc tròn đều đặn, đường kính khuẩn lạc trung bình khoảng 3 mm, riêng có một số lồi như: Acefobacter aceti, Acetobacter xylinum co khuan lạc nhỏ hơn đường
kính d = 1 mm), bé mat tron bóng, ở giữa khuẩn lạc dày hơn và đậm màu hơn
Trang 15nhiên cũng có những khuẩn lạc ăn sâu vào mơi trường, khó có thê gạt ra bằng que cấy
1.3.2 Đặc điểm màng của vi khuẩn 1cefobacrer trên môi trường lỏng Sự hình hành màng của vi khuẩn 4ce/obacfer trên môi trường dich rat đa dạng, trên bề mặt môi trường dịch có thể tạo nên các loại màng có độ dày
mỏng khác nhau Có loại màng dày như sứa, nhẫn và trơn, khi lắc nhẹ sẽ chìm
xuống đáy bình và có thể tiếp tục hình thành nên lớp màng mới Có loại màng mỏng như các tờ giấy xelofan, dai, nhan, khi lắc cũng chìm xuống đáy bình và tiếp tục hình thành nên lớp màng mới, dịch nuôi cấy trong, có mùi thơm dễ chịu Khi nghiên cứu các màng này thấy có nhiều sợi cellulose giống như các sợi bông, chắc khỏe được đan kết với nhau bởi chính các vi khuẩn
Acefobacter tạo nên độ dẻo dai, tính đàn hồi tốt và độ chắc khỏe của mảng Có những loại màng khác lại rất mỏng, dễ vỡ, không nhẵn hoặc nhăn nheo,
bám theo thành bình, dịch ni cấy thường đục có màu vàng nâu, khơng
trong, khơng có mùi thơm dễ chịu [1] [3]
Từ những quan sát về khuân lạc và các loại màng ở trên cũng góp phần
sơ bộ định loại các loài của vi khuẩn Acetobacter
1.3.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn 4cefobacfer [1] [3] [5]
Trong quá trình sinh trưởng và phát trién vi khuan Acetobacter co nhu cầu rất lớn đối với một số chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng Nguồn cacbon có thể được cung cấp từ các hợp chất đường, rượu etylic và các axit hữu cơ Vi khuẩn 4cefobacfer có thê sử dụng các muối amôn làm nguồn cung cấp nito Các chất kích thích sinh trưởng như: các axit amin (izoloxin, alanin,
prolin, valin), B-aminobenzoic, axit nicotinic, axit pantotenic, axit folic,
Trang 16Một số loài (Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti, Acetobacter
kiitzingianum .) có khả năng tự tổng hợp các polisaccarit phân tử lớn như: cellulose, dextran Dién hình là vi khuan Acetobacter xylinum cé thé tổng hợp được những sợi cellulose giống như những sợi bông
1.3.4 Con đường chuyển hóa cacbon [1] [3][5]
Nghiên cứu về khả năng chuyển hóa cacbon các tác giả đã di đến kết luận vi khuẩn axetic có thể oxi hóa cacbon theo những con đường sau:
Con đường thứ nhất: khơng có sự photphoril hóa cơ chất và sự tham gia
của các enzim đặc hiệu
Con đường thứ hai: oxy hóa cơ chất đã được photphoril hóa trong con đường pentozophôtphát
Con đường thứ ba: Entner -Doudoroff (E.D) Con đường thứ tư: chu trình Krebs hoặc Glyoxilat
1.3.5 Đặc điểm của một số loài vi khuẩn 4cefobacfer [1]
* Acetobacter aceti
Trực khuẩn ngắn hình que, xếp thành chuỗi dài, kích thước 0,4- 0,8 x 1,0- 1,2 um, khong di d6ng, bắt mau Gram 4m, bắt màu vàng với thuốc
nhuộm iốt Khuẩn lạc to sáng trên nền gelatin, dịch lên men chứa 10% đường saccarozơ, tạo thành màng nhày nhẫn, không được nâng lên theo thành bình Có thé phát triển ở mơi trường có nồng độ rượu cao ( 11%), tích
lũy được 6% axit axetic, nhiệt độ thích hợp là 30 °C, moi trường bia thích
hợp cho sự phát triển của loài này * Acetobacter suboxydans
Trang 17* Acetobacter hoshigaki
Trực khuẩn có kích thước từ 0,7 - 0,9 x 1,5 - 1,8 um, hay đứng riêng rẽ,
không di động Khuẩn lạc trên môi trường nước chiết đậu nành dạng hạt nhỏ,
tron, mau sáng, sau đó chuyên thành màu nâu Khuẩn lạc trên thạch với dịch
lên men: tròn, màu trắng sữa về sau chuyển hóa thành màu nâu, phía mép ngồi khuẩn lạc màu vàng nhạt Có thê chuyển hóa axit gluconic từ dextroza,
nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 30 - 35°C
* Acetobacter orleanense
Trực khuẩn dài vừa phải, không di động, khi gặp nhiệt độ cao có thể sinh
ra các tế bào dị hình: tế bào kéo dài hay phình to hơn Có khả năng phát triển
được trên mơi trường có nồng độ rượu cao từ 10 - 12% và tích lũy được 9,5%
axit axetic, nhiệt độ thích hợp 25 - 30 °C
* Acetobacter plancatum
Trực khuẩn, kích thước 0,4 - 0,6 x 1,4 - 1,6 um, té bao cé thé tao thanh những dạng phình to, kéo dai, không di động Khuẩn lạc tròn đều, hơi lồi lên, sáng, ấm ướt, nhớt, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 25 - 30 °C
* Acetobacter ascendens
Trực khuẩn, không di động, khuân lạc trên glucozo, gelatin khơ trắng, có vằng sáng chói Trên mơi trường lỏng tạo màng dây, chắc, hướng lên thành
bình, nhiệt độ thích hợp là 25 °C
* Acetobacter lindrenii
Trực khuẩn đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, không di động, một số tế bào phông to như hình cầu Khuẩn lạc trên gelatin với dịch lên men: nhỏ, tròn, màu vàng Ở môi trường lỏng váng màu nâu, nhớt, nhiệt độ thích hợp
Trang 18* Acetobacter acetosum
Trực khuẩn, kích thước từ 0,4 - 0,8 x 1 um Cac té bao đứng riêng rẽ và xếp thành chuỗi, không di động, nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 30 - 36°C
* Acetobacter schiitzenbachii
Tế bào hình que: 0,3 - 0,4 x 1,0 - 3,6 um, dimg riéng lẻ hoặc xếp thành đơi, có thé tao thành những tế bào đặc biệt Ở mơi trường già có thê tạo thành váng
dày, không bền vững, axit axetic tích lũy được trong môi trường khoảng 11,5 % * Acetobacter xylinum
Trực khuẩn có dạng hình que, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng chuỗi,
không di động được Các tế bào được bao bởi chất nhay, tao mang nhan va
khá dai, màng này bắt màu xanh với thuốc nhuộm iốt vì màng có chứa cellulose, tích lũy được khoảng 4,5% axit axetic trong môi trường, Acetobacter xylinum thường sống chung với nắm men trong một loại nước giải khát đân gian làm bằng nước chè đường loãng gọi là “Thủy hoài sâm”, người Trung Quốc gọi là “Hải báo” hay “Vị bảo”, người Nga gọi là “Nắm chè”
* Acetobacter pasteurianum
Có hình dạng tương tự 4 zcefi nhưng váng vi khuẩn có đạng khơ và
nhăn nheo, bắt màu xanh với thuốc nhuộm I›, tế bảo xếp rời nhau thành chuỗi,
đôi khi bắt gặp tế bào có dạng hình chùy phòng lên, di động không thường xuyên: khuẩn lạc trên gelatin nhỏ, tròn, nhiệt độ thích hợp để phát triển là
30C
*Acetobacter kiitzingianum
Có màng nhay, nhan ở mép và được nâng lên theo thành bình Tế bào
dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động, khuẩn lạc trên gelatin vớt dịch
lên men nhớt, nhỏ tạo thành màng xếp nếp to trên môi trường ẩm, thích hợp
Trang 19* Acetobacter orleanense
Truc khuan dai, té bao, không di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao có
thé sinh ra tế bào dị hình kéo dài hoặc phinh to ra Tạo váng vi khuẩn rat day trên môi trường lỏng, có thể phát triển trong mơi trường có nồng độ rượu cao
10 - 20 % và tích luỹ 9,5% axit axetic, thường đựơc dùng để chuyền hoá rượu vang thành giẫm theo phương pháp chậm, thích hợp phát triển ở 25 - 30°C
Hầu hết cac loai Acetobacter phat trién tot nhất ở 25 - 30°C, đều có khả
Trang 20CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu
2.1.1 Nguyên liệu chính
Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật thuần khiết được phân lập ở màng các nguồn nguyên liệu nhờ quá trình lên men giấm từ: bia, rượu vang, dịch hoa quả, giắm làm theo phương pháp cô truyền
Động vật thử nghiệm: thỏ nhà khỏe mạnh trọng lượng từ 1,4 - 1,6kg
2.1.2 Hóa chất và thiết bị 2.1.2.1 Hóa chất
Các hóa chất thơng dụng: glucozơ (C,H;;O,), cao nắm men, cao thịt,
pepfon, axit axetic, rượu etylic, NaOH, MgSO¿.7H;O, (NH¿);SO,, KH;PO,, K;HPO¿, CaCO;, agar - agar, phenolphtalein, thuốc nhuộm tím gentian, dung dịch fucshin, dung dịch lugol Tất cả các hóa chất đều tinh sạch ở mức phân
tích
Nước dừa nguyên chất, nước mía ép nguyên chất, dầu mù u (Thành phẩm mua ở hiệu thuốc Viện bỏng Quốc gia)
2.1.2.2 Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp Tommy (Nhật), máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh) , máy li tam Sorvall (MY), micropipet Jinson (Phap) các loại từ 20HI - 10ml, máy so màu UV - vis (Nhật), máy đo pH (MP 200 R -
Thuy Si), cân (Precisa XT 320 M - Thụy Sĩ) máy cất nước hai lần (Hamilton -
Trang 212.1.3 Các loại môi trường
2.1.3.1 Môi trường phân lập vi khuẩn giấm (MT]) [2] [4]
Glucozơ: 20g (NH¿);SO¿: 3g
KH;PO/¿: 2g MgSO„u.7H;O: 2g CaCO;: 7g Agar agar: 20g
Axit axetic: 2% Rượu etylic: 2%
(Bồ sung sau khử trùng) (Bồ sung sau khử trùng) Nước máy: 1000ml
2.1.3.2 Môi trường nhân giống cơ bản (MT2) [2] [4] Glucozo: 20g (NH¿);SO/:3g KH;PO/¿: 2g MgSO¿.7H;O: 2g
Pepton: 6g Axit axetic: 2% (B6 sung sau khử trùng) Nước máy: 1000ml Rượu etylic: 2% (Bồ sung sau khử trùng)
2.1.3.3 Các môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng [6]
TT Thành phần MT3 MT4 MT5 MT6 1 Glucozo 20g 20g 0g 20g 2 (NH¿);SO¿ 3 3 5 4 3 KH;PO¿ 2 2 2 1 4 MgSO,.7H,O 2 2 0 0 5 Axit axetic 2% 2% 5ml 2,5ml 6 Rượu etylic 2% 2% 0 0 7 Cao nâm men 0 Sg 3g 0 8 Pepton 0 6g 2g 0 9 Nước mía ép 0 0 200ml 0
10 Nước dừa 0 0 0 1000ml
Trang 222.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh
2.2.1.1 Phan lap ching vi khuan Acetobacter (vi khuan gidm) theo phương pháp của Vinogradski [2] [4]
Để có được chủng vi khuân 4cefobacter, chúng tôi tiễn hành quá trình phân lập vi khẩn từ các nguồn nguyên liệu: bia, rượu vang, địch hoa quả theo phương pháp của Vinogradski Trước hết thực hiện quá trình lên men giấm từ các nguồn nguyên liệu trên Vi khuẩn axetic là loài vi khuân hiếu khí nên chúng phát triển trên môi trường lỏng tạo thành một lớp màng dày, dai, màu trang - mang này là tập hợp các vi khuẩn axetic và màng cellulose, lẫy màng
đó đưa vào mơi trường số 2 ( môi trường số 2 (MT2) đã được hấp khử trùng ở latm, nhiệt độ 121°C, thời gian là 15 phút, để nguội, bố sung rượu và axit sau khi khử trùng) Sau khi thả màng vào môi trường số 2, giữ trong tủ ấm 28 -
30°C trong thời gian 4 - 7 ngày trên bề mặt môi trường xuất hiện một lớp màng mới Từ màng này tiến hành phân lập để thu nhận vi khuẩn Acetobacter
Trang 23lại như trên, ta sẽ thu được dịch pha loãng ở các mức độ: 101; 10; 10; ;
10'° Mức độ pha loãng quyết định bởi số lượng vi sinh vật, căn cứ vào số lượng vi khuân có trong mẫu, chúng tôi chọn mẫu ở độ pha loãng 10' - 107 đề tiến hành phân lập trên môi trường thạch dia
Phương pháp thạch đĩa: chuẩn bị môi trường 1 hấp khử trùng ở 121°C và
latm, để nguội, bổ sung rượu và axI(; tiếp theo đồ vào hộp petri đã vô trùng,
để nguội khi đó bề mặt thạch sẽ đông lại Dùng pipet vô trùng hút 10041 dịch màng đã chuẩn bị ở trên (có độ pha loãng 10'-10”) nhỏ vào lên trên bề mặt thạch, dùng que trang dàn đều các tế bào vi khuẩn lên trên khắp bề mặt thạch Bao gói cần thận, cất trong tủ ấm ở 28 - 30°C, sau 3 - 4 ngày lấy ra quan sat
khuẩn lạc (các đặc điểm về hình dạng kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền
mép quanh khuẩn lạc) và vòng phân giải CaCO; quanh khuẩn lạc Dựa trên
đặc điểm của khuẩn lạc thu được đối chiếu so sánh với đặc điểm của khuẩn
lac Acetobacter chon ra những khuẩn lạc của vi khuẩn axetic để tiến hành các
bước tiếp theo
Chú ý: tất cả các dụng cụ thí nghiệm, dung dịch và môi trường nuôi cấy trước khi sử dụng đều phải hồn tồn vơ trùng, các thao tác thí nghiệm đều được làm trong box cấy vô trùng
2.2.1.2 Tuyển chọn các chúng Acetobacter cho mang cellulose theo
phương pháp Graxinop [1] [2]|[4]
Trước khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn: môi trường 1 sau khi vô trùng đồ vào ống nghiệm, đậy nút bông, đặt nghiêng, để nguội Dùng que cấy đầu tròn (đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn) gợt lấy một khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào một ống thạch nghiêng theo đường ziczac,
với mỗi khuẩn lạc sẽ được mã hoá bằng một ký hiệu riêng Để vào tủ ấm 4 - 6
Trang 24Sau đó, tuyển chọn các chủng vi khuẩn 4ceíobacier trong mơi trường oxi hố (MT2) để kiểm tra khả năng tạo màng Cho 1ml nước cất thanh trùng
vào ống giống (ống nghiệm thạch nghiêng chứa các tế bào vi khuẩn đã được
hoạt hoá bằng cách cấy chuyền ống giống được bảo quản trong tủ lạnh sang
ống thạch nghiêng khác, khi tế bào vi khuẩn đã phát triển theo đường cấy sẽ
được sử dụng để kiểm tra khả năng tạo màng), đùng que cấy vô trùng gợt các tế bào ra đường cấy hoà tan vào nước, dùng pipet vô trùng hút dịch vi khuẩn đưa sang mơi trường oxi hố đề thử khá năng tạo màng Tiến hành tuyển chọn liên tiếp 3 lần, chúng tơi thu được chủng có khả năng tạo mảng tốt nhất đề dùng cho những nghiên cứu tiếp theo
Để giữ giống cần cấy chuyên giống theo chu kỳ 2 tháng 1 lần
2.2.1.3 Tuyển chon ching vi khuan Acetobacter xylinưm thuần khiết a) Phương pháp quan sát tế bào [2] [4]
Sau quá trình sơ tuyển, chúng tôi đã chọn ra một số chủng, các chủng này cần tiếp tục được xác định bằng phương pháp quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học để xác định xem có đúng là chủng vi khuẩn cần tìm khơng Quan sát hình dạng tế bào khi nhuộm Gram: phương pháp này gồm các bước sau:
- Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCI hoặc H;SO¿, rửa lại bằng cồn hoặc nước cất và lau khô
- Nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy lấy một ít màng trắng hoặc dịch nuôi cấy hoặc giống vi khuân hoà vào giọt nước Cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn (cách đèn cồn 10 - 15 cm)
Trang 25- Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho hết thuốc nhuộm chảy xuống chậu hứng, rửa bằng nước cat, nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi, giữ trong 5 phút
- Rửa tiêu bản bằng nước, cồn ( trong 20 giây), rửa lại bằng nước cắt - Nhỏ dung dịch Fucshin lên giữ trong I - 2 phút
- Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô tự nhiên Đưa lên kính quan sát Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn Gram
âm (G) với vi khuân Gram dương (G”).Khả năng bắt màu của G” và G khác
nhau do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn G” được cấu tạo từ một loại
protein đặc biệt chứa muối nucleatmagie, có khả năng tạo với tím gentian và
Iugol một phức chất bền khó bị rửa trôi, nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế
bảo vi khuẩn G” bắt màu tím của gentiam Trong khi đó những vi khuẩn Œ khơng có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm gentian và lugol nên
dễ bị rửa trôi bởi cồn Do đó, khi nhỏ fucshin lên tế bào vi khuẩn Œ sẽ bắt màu hồng của Fueshin
b) Kiểm tra đặc tính sinh học của Acetobacter [2}[4]
* Kiếm tra khá năng oxi hoá ethanol thành axit axetic
Như trên đã nói, 4cefobacter và Gluconomonas là 2 giống vi khuân có đặc tính hình thái, sinh lý tương tự nhau Vì vậy cần phải sơ tuyển chọn ra nhiing chung Acetobacter thuan khiét bằng phương pháp thử khả năng oxi hoá ethanol thành axit axetic trên môi trường A và B:
Môi trường A: dịch chiết nắm men: 3%; CaCO;: 2%; rượu etylic: 15% -
Trang 26Môi trường B: dịch chiết nắm men: 3%; agar - agar: 2%; rượu etylic:
15% - 2ml, Iml xanh lục bromocresol 2,2% Khi nuôi cấy vi khuẩn axetic trên
môi trường B nếu là Œ/cononbacter làm môi trường biến đối thành màu vang, néu la Acetobacter cing làm môi trường biến đổi thành màu vàng nhưng có một vành màu xanh lơ do q trình oxi hố các axit
* Phương pháp xác định khả năng tổng hợp axit axetic bằng chuẩn độ
với NaOH 0,1N co phenolphtalein lam chi thi [2][4]
Cho vao binh A loai 100ml (hay 250 ml): 10ml dịch lên men thêm vào đó 1 đến 2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N Tính số gam axit trong 100 ml dịch lên men
Lưu ý: Khi chuân độ cần lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang mau hồng nhạt bền trong 30 giây là được
Công thức tính: X = — (g/l)
Trong đó: X: số gam axit trong 11 dung dịch lên men
V: số ml NaOH 0,1N dùng chuẩn 10ml dung dịch lên men
K: lượng axit tong ứng với 1 ml NaOH 0,1N; K = 0,006 (déi với axit axetic)
10: số ml dịch đem chuẩn độ
* Phat hién hoat tinh catalase [2] [7][9]
Nhỏ 1 giọt H;ạO; 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu được tách
từ dịch, nuôi cây bằng li tâm 3000 vòng trong 20 phút Nếu thấy hiện tượng sủi bot thì chủng đó được cơi là có hoạt tính catalase (catalase +), néu khơng thấy sủi bọt thì chủng vi khuẩn đó khơng có hoạt tính catalase (catalase-)
c) Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn [2] [4]
Trang 27loãng Pasteur, dùng micropipet hút 100 „1 dịch pha loãng, trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 30°C trong 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dich nuôi cấy ban đầu theo công thức
1000 1
“100 10”
Trong đó: N - Téng sé CFU trong 1 ml dich nuôi cấy ban đầu A- Số CEU trung bình đếm được trên mỗi dia petri 10” - Độ pha loãng dịch nuôi cấy
2.2.1.4 Phương pháp tuyến chọn ching vi khudn Acetobacter xylinum cho mang mong [7] [8]
Mục đích nghiên cứu này là tuyển chọn được chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho mang mỏng, đai, chắc chế tạo màng sinh học dùng cho trị bỏng Do vậy chủng vi khuẩn được tuyển chọn thông qua các chỉ tiêu sau:
- Quan sat qua trinh hinh thanh mang dac diém tao thanh mảng trên môi trường lỏng ( dày, mỏng, nhăn, trơn, có ăn theo thành bình hay khơng)
- Quan sát đặc điểm của môi trường nuôi cấy các mẫu 4.xy/imm (đục hay trong)
- Xác định hàm lượng axit axetic tạo thành của mỗi mẫu
- Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học
- Đối chiếu so sánh đặc điểm giống nhau của các chủng đã phân lập được với các chủng đã biết dựa vào hệ số giống nhau để tuyên chọn các chủng cho màng mỏng
Trang 282.2.1.5.Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn 4cefobacfer
xylinum bằng phương phap do mat d6 quang (Optical Density — OD) [2] Buée 1: xdc định tương quan giữa số lượng tế bào (CFU) vi khuẩn Acetobacter xylinum với giả trị OD,¡o
- Lấy Iml dịch nuôi cấy vi khuân Acetobacter xylinum cho vào ỗng effendorf, đem ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ phút, bỏ phần dịch giữ lại phần sinh khối
- Cho 1ml nước cất vào phần sinh khối, vontex đều, tiếp tục quay ly tâm
( lặp lại 3 lần)
- Phần cặn còn lại hoà với Iml nước cất, vontex đều, pha loãng ở các độ
pha loãng khác nhau Ở mỗi độ pha loãng hút 100411 dịch trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi trong tủ ấm, sau 4 ngày đếm số lượng khuẩn lạc trong mỗi hộp petri Phần dịch pha loãng ở mỗi nồng độ đem đo OD ở bước sóng 610nm (đối chứng là nước cất - mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần)
- Xây dụng đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào với giá trị OD 6 A = 610 nm tương ứng ở các độ pha loãng khác nhau Ta sẽ có được một hàm số tương quan giữa 2 đại lượng này
Bước 2: xác định giá trị OD ở bước sóng 610 nm của dịch nghiên cứu,
dựa vào đồ thị chuẩn để tính ra số lượng tế bào có trong dịch nghiên cứu đó
vào các thời điểm nuôi cấy khác nhau 2.2.2 Phương pháp toán học [9][14]
Mục đích của phương pháp qui hoạch hóa tốn học thực nghiệm này là
xác định thành phần môi trường đinh dưỡng thích hợp, điều kiện nuôi cấy phù
Trang 29phép chúng ta nghiên cứu đồng thời tác động của nhiều yếu tố đến quá trình lên men cũng như sự tác động qua lại của các yếu tố đó
Thực tế có nhiều phương pháp để tối ưu nhưng người ta hay sử dụng
phương pháp Box - Wilson (phương pháp độ dốc) Đó là phương pháp cho
phép dẫn dắt các yếu tố đến vùng tối ưu khi các biến này đồng thời thay đổi
cùng một lúc
Phương pháp Box - Wilson gồm hai bước chính: 2.2.2.1 Thiết lập mơ hình tốn học
Mục đích việc thiết lập mơ hình toán học cho phép ta thấy được mối liên hệ giữa hàm mục tiêu với các biến dưới dạng mặt đồng mức Mặt đồng mức
được biểu diễn bằng phương trình hồi qui có đạng:
y =b, +b,X, +b, X, +b, X,
Trong do: y: Ham muc tiéu X, : Biến sé ma (Kod)
bị : Các hệ số
Phương pháp Box - Wilson chỉ có hiệu quả khi mơ hình tuyến tính, các hệ số của phương trình đều có nghĩa Nếu hệ số nào khơng có nghĩa thì cần loại khỏi mơ hình
- Để thiết lập mơ hình toán học phải tiến hành các bước sau:
Xác định các chỉ tiêu tối ưu
Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu tối ưu Xác định mức của các biến
Mức 0: là tương ứng với các giá trị x; _— a: giới hạn dưới của khoảng xác định
Trang 30~-1 ~0
Mức dưới: tương ứng là x: <x:
~+! ~0
Mức trên: tương ứng với x: >x:
Xác định khoảng biến thiên của các yếu tố, đó là khoảng bé nhất khi biến số thay đổi một lượng như vậy, thì sẽ dẫn đến sự thay đổi trông thấy của
hàm mục tiêu
Ma trận thực nghiệm: số thí nghiệm phải làm (N) để thiết lập mô hình
với n yếu tổ là: N = 2° với œ là số mức
Kiểm tra sự hội tụ của các số liệu
Mục đích để xem các số liệu có cùng một độ chính xác khơng, đầu tiên
cần tính phương sai:
¬ n k-I“'
Trong đó: k: Số lần đo lặp lại của thí nghiệm
y, : Số đo trung bình của thí nghiệm
Yj: Số đo lần thứ ¡ của thí nghiệm
max S?
Tiếp tục tính: G,„=——” (Grr = Ginn ton) (4)
>S;
Điều kiện để các sai số hội tụ 1a: Grr < Gg (Gg: là Gs¿„„) G; tính được
bằng cách tra bảng chuẩn Corhran khi biết bậc tự do f, =k - 1 va f =N
Tính các hệ số của phương trình hồi qủ Các hệ số hồi qui được xác định:
vy (5)
N
Trang 31Tắt cả các hệ số trên giúp ta xác định được mức độ ảnh hưởng của các biến lên hàm mục tiêu Dấu của các hệ số cho biết hiệu ứng tác động của các
biến tương ứng lên hàm mục tiêu theo chiều hướng nào
Đối với những hệ số quá bé có thể coi là khơng có nghĩa nên hầu như
không ảnh hưởng gì tới hàm mục tiêu và được loại khỏi mô hình
Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ SỐ
Các hệ số thu được đánh giá dựa vào tiêu chuẩn Student, các hệ số
không có nghĩa thì bị loại khỏi mơ hình Hệ số có nghĩa thì u cầu phải thỏa
mãn |b.|>S, +
Với t: giá trị chuẩn Student được xác định bằng cách tra bảng khi biết trước N và bậc tự do f = N (k-1)
S, được xác định bằng:
Tính phân phối trung bình của từng thí nghiệm 1 N
si == S7 yes Œ) 7
Tính phân phối trung bình cho mỗi lần đo:
= ` kh (8)
TONKS!
Tính phân phối mà các hệ số xác định:
> ÚB (9)
B: là hệ số của phương trình hồi qui
- Thông thường giữa số liệu thực nghiệm và mơ hình bao giờ cũng có
những sai lệch nhất định, để đánh giá độ sai lệch giữa thực nghiệm và mơ
hình ta dung tiéu chuan Fisher
- Mơ hình chỉ thích ứng khi Frr < Eạ, trong do F, tim duoc bằng cách tra
Trang 32- Để tính tốn chuẩn Fisher theo mơ hình ta phải tính tốn giá trị của hàm số theo mơ hình đã tìm được và tính phương sai thích ứng theo công thức
sau:
2
2 1 =I
Sy =—= (v7 -7") (Sry = Savin eng) (10)
—TN
y, : giá trị trung bình của số liệu thực nghiệm nhận được ở thí nghiệm thứ j
y,`: giá trị của hàm y tính theo phương trình:
3 “TU
Frr TT = Min(S?;S3, ) ( F TT = Fain joan tínht ) ( 11 )
Trong đó: S” được xác định theo (8); Frr < Fg (F bang)
_ Max(S?;si,,)
2.2.2.2 Tối ưu hóa
Q trình tối ưu hóa được thực hiện gồm 2 bước:
Bước I1: Dựa vào phương trình hồi qui ta soạn ra một chương trình gồm một số thí nghiệm với những giá trị thay đổi của các yếu tố x; theo chiều hướng thắng đứng
Lập ma trận thực nghiệm, ma trận này được xác định từ mức 0 của các
biến số Các giá trị tiếp theo của chúng thì dựa vào bước nhảy đã xác định ở trên
Bước 2: Tiến hành thí nghiệm theo ma trận, sau đó rút ra những kết luận
từ những kết quả thực nghiệm
* Phương pháp xác định khoảng tin cậy của các kết quả đo Khoảng tin
cậy của kết quả đo với độ tin cậy B được xác định như sau:
x=x¢ tap vn (13)
- le
Trong đó: x: là kỳ vọng toán học của đại lượng x¡ và x= —3`x, (14)
Trang 33tg: giá trị thu được từ bảng phân phối Student voi (n-1) bac tu
do ứng với mức ý nghĩa œ = I -
Độ lệch chuẩn tính theo công thức S= q5)
* Phương pháp tính trung bình tổng thể
Theo cơng thức: M= y x (16)
ist 1
Trong đó: M: là giá trị trung bình tổng thể
X;: gia tri cua mỗi kết qua thí nghiệm từ 1 đến n
n: số lần thí nghiệm
2.2.3 Phương pháp tạo chế phẩm màng sinh học cellulose từ
Acetobacter xylinum [7] [8]
2.2.3.1 Công đoạn sinh học
Cac ching A xylinum duge bao quan trong các ống thạch nghiêng cần được hoạt hoá trở lại trước khi nhân giống các cấp và nuôi cấy tạo màng sinh
học
- Nhân giống: nhân giống cấp I với mỗi ống thạch nghiêng chứa giống
được cho vào bình tam giác chứa sẵn 200 ml địch lên men, để trong điều kiện nhiệt d6 28 - 30°C, cho vi sinh vat phat trién trong 72 gio Sau do, tién hanh
nhân giống cấp 2 với tỷ lệ nhân giống là 10%, sau 72 giờ lại tiếp tục nhân
giống cấp 3 Quá trình nhân giống nhằm đảm bảo có đủ số lượng tế bao vi sinh vật cho quá trình lên men
Trang 342.2.3.2 Công đoạn hoá học
Trong giai đoạn này chúng tôi tiến hành các bước sau:
- Tach san pham: sau 3 - 4 ngày trong dịch lên men đã hình thành lớp
màng ở phía trên, tiến hành thu sinh khối, vớt lớp màng ra khởi dịch nuôi cấy
bằng đũa thuỷ tinh Trong quá trình vớt màng phải tuyệt đối vô trùng để các
vi sinh vật khác không nhiễm vào dịch lên men, dịch lên men sau khi thu sinh
khối có thể bổ xung thêm chất dinh dưỡng để tiếp tục thu sinh khối (các công đoạn đều được làm trong box cấy vô trùng)
- Màng thu được đem rửa bằng nước cắt 3 lần
- Xử lý màng bằng dung dịch kiềm loãng NaOH 3% ở 30” trong 30 phút
- Trung hoà màng thu được bằng nước chanh loãng (hoặc HCI 3%) - Ngâm màng với NaOH 3% ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ
- Trung hồ bằng nước chanh lỗng hoặc HCI 3% - Tiệt trùng màng BC
- Tạo chế phẩm màng sinh học: sau khi qua các công đoạn trên màng BC sẽ được tắm các hoạt chất làm tăng khả năng điều trị bỏng là dầu mu u Chế phẩm thu được là màng BC - mù u
2.2.4 Mơ hình thử nghiệm tác dụng sinh học cúa chế phẩm BC mù u * Mô hình gây vết thương ở thỏ: dùng kéo cắt bỏ miếng đa thỏ diện tích 4cnÏ ở các vị trí giống nhau
* Phương pháp tiến hành: để xác định khả năng làm vết thương nhanh
lành nhất của các chế phâm sử dụng, chúng tôi tiến hành làm các thí nghiệm
và chia thành các lô sau:
- Lô 1: đắp màng BC - mù u
- Lô 2: đắp gạc y tế có tâm dầu mù u - Lô 3: chỉ bôi dầu mù u
Trang 35Sau khi đã tạo ra các vết thương dùng màng và gạc đắp lên vết thương, sau 24 giờ thì thay một lần
Trang 36CHƯƠNG 3
KET QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Tuyển chọn vi khuẩn 4ceobacfer từ các nguồn vật liệu
Để tuyển chọn chủng Acetobacter ching t6i tién hanh 1én men giam tir các nguồn nguyên liệu là bia, dịch hoa quả, rượu vang Trước tiên, cho vào bình tam giác dung tích 500 ml, 250ml giấm, bổ sung 2ml rượu etylic và axit axetic, lát chuối tiêu đã bóc vỏ ( cung cấp thêm nguồn gluxit và vitamin)
Mục đích của chúng tôi là lựa chọn vi khuẩn axetic nên việc bố sung axit
axetic nhằm axit hoá mơi trường kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn khác chỉ để nồng độ axit trong môi trường thích hợp cho sự phát triển của các
chủng axetic Đậy nút bông, nuôi ở tủ ấm 28 - 30°C, sau 4 - 7 ngày trên bề
mặt thống của bình xuất hiện I lớp màng trắng dai - đó là tập hợp các vi khuẩn axetic Lấy những màng dai, đưa vào các nguồn nguyên liệu trên, tiếp tục nuôi trong tủ ấm đến khi xuất hiện màng trắng và dai Từ các mẫu màng này chúng tôi tiến hành phân lập tuyên chọn chủng vi khuan Acetobacter
Tiến hành phân lập trên môi trường thạch đĩa: dùng que cấy sạch lấy một
lượng màng nhất định cho vào ống nghiệm chứa nước cất, vontex đều, tiễn
hành pha loãng nồng độ theo phương pháp của Pasteur Sử dụng nồng độ 10 - 10” để tiến hành phân lập trên môi trường thạch đĩa, bao gói ni trong tủ
ấm Sau 4 - 7 ngày trên bề mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc có đường kính khác nhau Dựa vào đặc điểm của các khuẩn lạc vi khuẩn 4cefobacter, chúng
Trang 37hành thử khả năng tạo màng của các chủng trên môi trường số 2, chúng tôi
chỉ lựa chọn những chủng tạo màng mỏng, độ dàn hồi tốt, nhẫn, không nhăn,
không ăn theo thành bình Qua 3 lần liên tiếp từ 100 mẫu này chúng tôi thu
được 47 mẫu tạo màng cellulose tốt nhất - đây là các chủng vi khuân axetic, các chủng này cần được tuyên chọn tiếp để xác định chính xác đâu là chủng Acetobacter xylinum
3.2 Tuyén chon ching Acetobacter xylinum thuan khiét 3.2.1 Kiểm tra khả năng oxi hoá ethanol thành axit axetic
Để xác định các mẫu này có phải là 4ceobacter hay không chúng tôi vẫn tiếp tục thử khả năng oxi hố trên mơi trường số 2, sau 6 ngày tiến hành
chuẩn độ đề xác định ham lượng axetic được tạo thành Đồng thời tiến hành
thử khả năng oxi hố trên mơi trường A và B xác định xem mẫu nào là
Acetobacter, mau nao 1a Gluconobacter
Với môi trường A va B dùng để thử khả năng oxi hoá etanol của các chủng vi khuân axetic đã phân lập được:
Khi cấy các chủng trên vào môi trường A: nếu là Gi/conobacter sẽ có một vòng sáng xung quanh khuân lạc Néu la Acetobacter thi vòng sáng sẽ rõ hơn và có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc hướng về phía vùng sáng, lớp cặn đục này chính là vòng phân giải CaCO; do axit axetic sinh ra gây phản ứng với
CaCO; mà thành, lớp cặn đục này xuất hiện vào ngày thứ 6 — 7
Với môi trường B: nếu là Giuconobacfer làm biến đổi môi trường thành
màu vàng Nếu là 4cefobacfer cũng làm biến đổi môi trường thành màu vàng nhưng có một viền màu xanh lơ do q trình oxi hố các axit
Kết quá chúng tôi tuyển chọn được 6 mẫu vi khuẩn Acetobacter Lam
tiêu bản 6 mẫu trên với thuốc nhuộm là I; và HạSO¿, quan sát trên kính hiển vi
Trang 38Nuôi cấy 6 mẫu này trong môi trường dịch thể sau 6 ngày xác định lượng axit axetic tạo thành Các chủng trên đều có khả năng sản sinh axit axetic trong q trình ni cấy Thực chất của quá trình này chính là sự oxi hóa khơng hồn tồn rượu etylic dưới tác dụng của Acefobacter xylinum (hàm lượng axit axetic của 6 chung được trình bày ở bảng 3.1) Trong 6 chủng trên hàm lượng axit
axetic sinh ra dao động từ 2,89 (G:¡) đến 3,15 (D,3) Chủng D;; lượng axit
axetic sinh ra là lớn nhất đây là một thuận lợi trong q trình ni cấy và sản xuất màng cellulose
Bảng 3.1 Hàm lượng axit axefic của một số chủng vi khuẩn 4cefobacfer
Trang 39
Hàm lượng axit axetic G51 D26 D13 G47 D3 [1% axit acetic
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hàm lượng axit axetic
3.2.2 Kiểm tra một số đặc tính sinh học của các chủng 1cefobacfer Sau ching 4ce/obacter xylimm đã xác định được ở trên chúng tôi tiếp tục nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng này
* Về đặc điểm khuân lạc: tròn, đều, trơn bóng, màu sắc trắng trong hoặc trắng sữa (tuỳ môi trường nuôi cấy), mép khuẩn lạc nhẫn, sau 5 — 6 ngày kích
thước đạt từ 0,8 — 2 mm, độ đồng đều của các khuẩn lạc cao, đồng nhất
* Kiểm tra thông qua các đặc điểm sinh hoá:
Kiểm tra hoạt tính catalase của 6 chủng trên ta đều thấy có hiện tượng sui bọt khí, điều này chứng tỏ 6 chủng này đều có hoạt tính catalase dương
Kiểm tra khả năng tạo màng trên mơi trường Hoyer thì thấy màng không xuất hiện
Trang 40Quan sát môi trường nuôi cấy chúng tôi thấy váng vi khuẩn xuất hiện màu lam, không thấy xuất hiện sắc tố nâu trên môi trường thạch
Kết quả chúng tôi thu được ở bảng sau:
Bang 3.2 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn 1cefobacfer
xylinum
Đặc điêm sinh hoá của vi oa Ket TT khuan Acetobacter xylinum Hiện tượng quả
Oxy hoa ethanol thanh axit Axit axetic tạo ra kết hợp vor 1 axetic và tạo lớp cặn đục rõ CaCO, lam vong sang r6ng hon} ` cv ~ +
2_ | Catalase Sủi bọt khí +
3 | Hoyer Sinh khối không phát triên — 4 Chun hố glucozơ thành | Vịng sáng xuât hiện xung quanh +
axit khuan lac
5 Kiêm tra khả năng sinh sắc tô | Không thây sắc tô nâu _ nau
6 Kiểm tra khả nang tong hop | Vang vi khuẩn xuất hiện màu lam + cellulose
3.2.3 Kiểm tra khả năng hình thành màng cellulose của 6 chủng Acetobacter xylinum
Acetobacter xylinum la nhom vi khuan c6 kha nang tong hgp cellulose
manh[15] [18] Do vay chung t6i tuyén chon bang cách thử kha nang tao
màng trên môi trường dịch thể (MT2), trong cùng điều kiện nuôi cấy như
nhau và chỉ lựa chọn những chủng cho màng mong, dai, nhẫn, độ đàn hồi tốt
Kết quả tất cả 6 chủng vi khuân thuộc các nhóm trên đều có khá năng tạo thành màng trên môi trường lỏng độ dày của màng từ 0,8 — 2 mm, độ đàn hồi
tốt, thời gian hình thành màng từ 4 đến 6 ngày Cụ thê: