Nghiên cứu một số tính chất sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn chuyển hóa nitơ có khả năng tạo màng sinh học (biofilm) để ứng dụng trong công nghệ xử lý nước nhiễm amoni

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC oOo HOÀNG THỊ HOA DIỄM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT SINH LÝ, SINH HÓA CỦA VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC (BIOFILM) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ XỬ LÝ NƢỚC NHIỄM AMONI LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC oOo HOÀNG THỊ HOA DIỄM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT SINH LÝ, SINH HÓA CỦA VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC (BIOFILM) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ XỬ LÝ NƢỚC NHIỄM AMONI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. HOÀNG PHƢƠNG HÀ Thái Nguyên – 2013 i Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là một phần kết quả trong đề tài nghiên cứu của phòng Công nghệ sinh học môi trƣờng, Viện Công nghệ sinh học. Các kết quả này đảm bảo trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 08 năm 2013 Tác giả luận văn Hoàng Thị Hoa Diễm ii Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn trân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Phương Hà, PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những người thầy mẫu mực đã dành cho tôi những ý tưởng quý báu cũng như tận tụy hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị trong phòng Công nghệ Sinh học Môi trường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong việc nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Viện trong suốt thời gian qua. Đồng thời tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới các thầy cô trong Khoa Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã truyền đạt những kiến thức bổ ích và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Cuối cùng tôi muốn gửi lời cám ơn chân thành đến những người thân trong gia đình và bạn bè thân thiết đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. iii Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT amoA Gene encoding the subunit A of AMO Amp Ampiciline AOB Ammonia oxidyzing Bacteria ATP Adenosine triphosphate ĐC Đối chứng Đtg Đồng tác giả DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid 16S rRNA 16S ribosomal Ribonucleic acid iv Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1. Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn ch a NH 4 + với nƣớc cất 23 Bảng 2.2. Tỷ lệ pha loãng dung dịch chuẩn + nƣớc cất và hàm lƣợng N-NO 2 - 25 Bảng 2.3. Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn + nƣớc cất và hàm lƣợng N-NO 3 - 26 Bảng 3.1. Khả năng oxy hóa amoni của nhóm vi khuẩn phân lập 32 Bảng 3.2. Khả năng tạo màng sinh học của của vi khuẩn oxy hóa amoni 33 Bảng 3.3. Khả năng oxy hóa nitrite của nhóm vi khuẩn đƣợc phân lập 35 Bảng 3.4. Khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn oxy hóa nitrite 35 Bảng 3.5. Ảnh h PD60 và PD58 50 Bảng 3.6. Ảnh h 5NM 51 v Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 1.1. Tế bào của một số loài thuộc nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni 9 Hình 3.1. Các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trƣờng Winogradsky. 31 Hình 3.2. Khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn oxy hóa amoni 34 Hình 3.3. Khả năng tạo màng sinh học của các chủng oxy hóa nitrite 36 Hình 3.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 38 Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loại của vi khuẩn nitrate hóa PD60, PD58, 5NM và 2NM 40 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn nghiên cứu 42 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng tạo biofilm ng của vi khuẩn nghiên cứu 43 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn nghiên cứu 45 Hình 3.9. Ảnh hƣ ng của vi khuẩn nghiên cứu 46 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của NaCl tới hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn nghiên cứu 48 Hình 3.11. Ảnh hƣ ng của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 49 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ nitơ ng của vi khuẩn nghiên c u 52 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỤC LỤC TRANG LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Hiện trạng ô nhiễm và nguồn gốc phát sinh các hợp chất nitơ trong nƣớc 3 1.1.1. Hiện trạng ô nhiễm các hợp chất nitơ trong nƣớc 3 1.1.2. Tác hại của các hợp chất chứa nitơ đối với cơ thể con ngƣời 4 1.1.3. Nguồn gốc phát sinh các hợp chất chứa nitơ trong môi trƣờng sống 5 1.2. Cơ sở của phƣơng pháp khử nitơ sinh học 6 1.2.1. Cố định nitơ 6 1.2.2. Quá trình khoáng hóa 7 1.2.3. Quá trình nitrate hóa 7 1.2.4. Quá trình khử nitrate 7 1.3. Vi khuẩn nitrate hóa tự dƣỡng 7 1.3.1. Vi khuẩn oxy hóa amoni nitroso) 8 1.3.2. Vi khuẩn oxy hóa nitrite (vi ) 11 1.4. Màng sinh học (Biofilm) 13 1.4.1. Khái niệm về biofilm 13 1.4.2. Thành phần của biofilm 13 1.4.3. Ảnh hƣởng của một số điều kiện hóa lý đến sự hình thành và phát triển của biofilm 16 1.4.4. Màng sinh học của vi khuẩn nitrate hóa tự dƣỡng 17 1.5. Phân loại vi khuẩn bằng xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA 18 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1.Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc 20 2.1.1. Vật liệu 20 2.1.2. Hóa chất và enzyme 20 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 20 2.2. Các môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn. 21 2.2.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn nitrate hóa 21 2.2.2. Môi trƣờng LB 21 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.3.1. Phân lập vi khuẩn nitrate hóa 21 2.3.2. Xác định hàm lƣợng amoni trong nƣớc ngọt theo phƣơng pháp Nessler 22 2.3.3. Xác định hàm lƣợng NO 2 - bằng phƣơng pháp Griss 24 2.3.4. Xác định hàm lƣợng NO 3 - bằng phƣơng pháp Salicylate 25 2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá khả năng tạo màng sinh của các chủng vi 26 2.3.6. Ảnh hƣởng của một số điều kiện lên khả năng tạo màng sinh học và hoạt tính nitrate hóa 27 2.3.7. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 29 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 31 3.1. Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn nitrate hóa 31 3.1.1. Phân lập 31 3.1.2.Khả năng nitrate hóa và tạo màng sinh học (Biofilm) 32 36 , sinh tr sinh học 41 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 [...]... nitrate hóa Ở nƣớc ta những nghiên cứu về màng sinh học của nhóm vi khuẩn này còn rất mới mẻ Vì vậy: chúng tôi đề xuất đề tài: Nghiên cứu một số tính chất sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn chuyển hoá nitơ có khả năng tạo màng sinh học (biofilm) để ứng dụng trong công nghệ sử lý nƣớc ô nhiễm amoni Mục tiêu: Lựa chọn một số chủng vi khuẩn có hoạt tính nitrate hóa cao và tạo màng sinh học Nội dung nghiên cứu: ... Một trong các Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2 phƣơng pháp xử lý sinh học đem lại hiệu quả cao, đó là sử dụng màng sinh học (Biofilm) do các vi sinh vật tạo ra Tại Vi t Nam, trong những năm gần đây các công nghệ loại bỏ các hợp chất chứa nitơ bằng biện pháp sinh học đã và đang đƣợc quan tâm Một trong số đó là công nghệ ứng dụng sự hình thành màng sinh học của nhóm các vi khuẩn. .. sẽ cho khả năng loại bỏ nitơ tốt nhất Do vậy, cần phải có sự sục khí thích hợp để quá trình loại bỏ nitơ đạt hiệu quả cao Sự tạo màng sinh học của vi khuẩn nitrate hóa ảnh hƣởng đến tốc độ sinh trƣởng của vi sinh vật trong màng và khả năng loại bỏ các hợp chất nitơ trong nƣớc Khi các vi khuẩn này đƣợc cố định trên các giá thể nhờ màng sinh sẽ tăng khả năng sống sót của chúng và tăng khả năng sinh trƣởng... hợp chất chứa nitơ trong nƣớc ngầm [2] 1.2 Cơ sở của phƣơng pháp khử nitơ sinh học Phƣơng pháp khử nitơ sinh học dựa vào chu trình chuyển hóa nitơ của vi sinh vật trong tự nhiên Vòng tuần hoàn của nitơ bao gồm cố định nitơ, quá trình khoáng hóa của vi khuẩn, quá trình nitrate hóa và quá trình khử nirate 1.2.1 Cố định nitơ Sự sống của vạn vật trên trái đất đều có nhu cầu đối với các hợp chất nitơ để tạo. .. hiện chủ yếu nhờ một số loài vi khuẩn Ngoài các vi khuẩn hay sinh vật cố định nitơ tự do trong đất, có một vài nhóm sinh vật sống cộng sinh với thực vật nhƣ cây họ đậu, trong khi đó một số nhóm khác sống cộng sinh với động vật nhƣ mối, hà Một số đại diện của vi khuẩn Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 7 lam cũng có thể cố định nitơ Sự cố định nitơ sinh học đòi hỏi một phức hệ enzyme... dạng của vi khuẩn nitrate hóa 1.3.1 Vi khuẩn oxy hóa amoni nitroso) 1.3.1.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn oxy hóa amoni Vi khuẩn oxy hóa amoni là nhóm vi khuẩn gram âm, hóa tự dƣỡng và hiếu khí bắt buộc Vi khuẩn này lấy năng lƣợng từ quá trình oxy hóa amoni thành nitrite Quá trình oxy hóa amoni xảy ra theo phƣơng trình sau: 2NH4+ + 3O2 → 2NO2- + 2H2O + 4H+ + năng lƣợng cho tế bào sinh trƣởng Vi khuẩn. .. và nghiên cứu một số vi khuẩn nitrate hóa tiêu biểu * Phân loại vi khuẩn tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử * Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính nitrate hóa, sinh trƣởng và tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hiện trạng ô nhiễm và nguồn gốc phát sinh các hợp chất nitơ trong. .. chủng vi khuẩn sinh trƣởng trong điều kiện hiếu khí, nhƣng một số chủng có thể sinh trƣởng trong điều kiện thiếu oxy [53] Những nghiên cứu về đặc điểm sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn oxy hóa amoni cho thấy, vi khuẩn oxy hóa amoni có thể tồn tại trong khoảng nhiệt độ từ 5 đến 35oC, pH từ 5,8 đến 8,5 [52] Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng của chúng từ 25 đến 30oC [35], pH tối ƣu cho của vi khuẩn nitrate hóa. .. độ amoni tối ƣu trong khoảng 2-10 mM [13] Độ ẩm và pH là những yếu tố có vai trò quan trọng ảnh hƣởng tới sinh trƣởng và hoạt tính chuyển hóa nitơ của vi khuẩn nitrate Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 9 Nitrosomonas Nitrosospira Nitrosococcus Nitrosolobus Nitrosovibrio Hình 1.1 Tế bào của một số loài thuộc nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni [30] Một số chủng vi khuẩn oxy hóa amoni có. .. nhóm vi khuẩn này đã và đang đƣợc các nhà khoa học tập trung nghiên cứu để ứng dụng 1.3.2.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn oxy hóa nitrite Nhóm các vi khuẩn oxy hóa nitrite tự dƣỡng đƣợc biết đến nhƣ là vi khuẩn tự dƣỡng hóa năng (chemoautotroph) hay tự dƣỡng vô cơ (lithautotroph) [13], Gram âm và hiếu khí Chúng có khả năng sử dụng nitrite nhƣ là chất cho điện tử, lấy năng lƣợng từ quá trình oxy hóa . VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC (BIOFILM) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ XỬ LÝ NƢỚC NHIỄM AMONI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG. nhóm vi khuẩn này còn rất mới mẻ. Vì vậy: chúng tôi đề xuất đề tài: Nghiên cứu một số tính chất sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn chuyển hoá nitơ có khả năng tạo màng sinh học (biofilm) để ứng dụng. LÝ, SINH HÓA CỦA VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC (BIOFILM) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ XỬ LÝ NƢỚC NHIỄM AMONI LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái