2.3.7.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số
Vi khuẩn nitrate hóa đƣợc nuôi cấy trong 10ml môi trƣờng Winogradsky I (hoặc Winogradsky II) chứa 10 mg/l N trong điều kiện pH 7,5; nuôi lắc 200 v/ph ở 28±2˚C, sau 5 ngày nuôi cấy tiến hành tách chiết DNA genom của chúng theo các bƣớc sau: Dịch nuôi cấy đƣợc chuyển vào ống eppendoft 2 ml, ly tâm 8000 v/ph trong 5phút thu sinh khối của tế bào. Bổ sung thêm 540 μl extraction buffer và 5 μl proteazek 20 mg/ml đảo nhẹ nhàng sau đó ủ ở 37˚C trong 1,5 giờ. Bổ sung 60 μl SDS 20% ủ ở 65˚C trong 2giờ. Sau đó bổ sung chloroform : izoamyl alcohol tỉ lệ 24:1 với thể tích 1:1 (VD: 600 μl mẫu thì bổ sung 600 μl chloroform : izoamyl alcohol). Đem dịch li tâm ở 12000 v/ph ở 4˚C trong 15 phút để loại bỏ protein thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft mới. Trong trƣờng hợp dịch thu đƣợc chƣa sạch nghĩa là đang còn nhớt ta lặp lại đến khi hết nhớt thì thôi. Sau đó bổ sung izopropanol theo tỉ lệ 1:1 để ở nhiệt độ phòng 1giờ rồi li tâm 12000 v/ph trong 15 phút bỏ dịch thu tủa. Tủa là DNA genom đƣợc thu lại. Rửa tủa bằng ethanol 70% và đƣợc làm khô bằng máy hút chân không. Cuối cùng bổ sung 25 μl nƣớc khử ion để ở nhiệt độ phòng để làm tan hoàn toàn DNA sau đó bảo quản trong tủ lạnh.
2.3.7.2. Kỹ thuật PCR
Phản ứng chuỗi polymerase dựa trên nguyên tắc khuếch đại đoạn gen DNA đặc biệt trong điều kiện in vitro nhờ cặp mồi đặc trƣng. Cách tiến hành nhƣ sau: Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với tổng thể tích cuối là 25 μl chứa các thành phần: 2,5 μl buffer 10X; 2,5 μl dNTPs 2,5mM; 3μl MgCl2 10mM;
1μl mồi 16Sf; 1μl mồi 16Sr; 0,3μl Tag-DNA polymerase 1U/μl; 11,7 μl dH2O.
Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng PCR: i). 94oC/ 4 phút; ii). 94oC/ 1 phút; iii). 56oC/ 1 phút; iv). 72oC/ 1 phút 20 giây; v). 72oC/ 8 phút; vi). 8˚C-∞. Từ bƣớc 2-4 lặp lại 32 chu kì.
2.3.7.3. Điện di trên gel agarose
Các đoạn gen có kích thƣớc và điện tích khác nhau đƣợc tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng của máy điện di trong điện trƣờng có điện thế và cƣờng độ thích hợp. Quy trình tiến hành điện di nhƣ sau: gel agarose 0,8-1% đƣợc chuẩn bị; mẫu DNA đƣợc trộn với 1μl đệm tra mẫu và đƣợc tra vào các giếng nhỏ trên gel, chạy điện di (80-100V; 350-400mA) với chỉ thỉ phân tử DNA chuẩn để xác định trọng lƣợng phân tử, quan sát sự di chuyển màu để ngừng quá trình điện di (khoảng 30-35 phút); bản gel đƣợc lấy ra khỏi khuôn và đƣợc ngâm trong dung dịch EtBr 0,5μl/ml trên máy lắc trong 10 phút; bản gel đƣợc rửa bằng H2O, quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA và chụp ảnh.
2.3.7.4. Xác định và xử lý trình tự nucleotit của gen
Trình tự DNA đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Sanger và đtg trên máy trình tự từ DNA tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosytems) với bộ kit xác định trình tự BigDye Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystem.
Sử dụng các phần mềm Bioedit, BLAST và CLC sequence Viewer để xử lí và so sánh trình tự nhận đƣợc với các trình tự gen 16S rRNA khác trong ngân hàng gen Quốc tế.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN