Lớp ngoài cùng của màng sinh học là lớp hiếu khí, bên trong là lớp kỵ khí. Bề dày của lớp hiếu khí không thay đổi trong một điều kiện hoạt động nhất định, khi bề dày của lớp hiếu khí tăng theo tốc độ phát triển của vi sinh vật, phía trong của lớp hiếu khí sẽ chuyển thành kỵ khí vì thiếu oxy. Một trong những vai trò của kỵ khí là hóa lỏng những chất rắn do màng sinh ra, góp phần làm giảm lƣợng bùn dƣ. Sự tồn tại đồng thời của hai lớp màng hiếu khí và kỵ khí có khả năng loại bỏ nitơ trong nƣớc thải, bởi vì đồng thời xảy ra quá trình nitrate hóa và khử nitrate. Theo đó lớp hiếu khí đóng vai trò nitrate hóa và lớp kỵ khí đóng vai trò khử nitrate. Một phần nitrate sản sinh ra trong lớp hiếu khí đi ra chất lỏng, phần còn lại bị lớp kỵ khí chuyển thành N2. Khi nồng độ oxy hoà tan cao, bề dày lớp hiếu khí lớn thì quá trình nitrate hóa nhanh và mạnh hơn, nhƣng tỉ lệ khử nitrate giảm vì bề dày của màng kị khí
giảm đi. Ngƣợc lại, nếu nồng độ oxy hòa tan trong nƣớc quá thấp thì khả năng khử nitrate lớn nhƣng khả năng nitrate hóa bị giảm. Do đó, lƣợng oxy hoà tan tối ƣu trong nƣớc thải sẽ cho khả năng loại bỏ nitơ tốt nhất. Do vậy, cần phải có sự sục khí thích hợp để quá trình loại bỏ nitơ đạt hiệu quả cao.
Sự tạo màng sinh học của vi khuẩn nitrate hóa ảnh hƣởng đến tốc độ sinh trƣởng của vi sinh vật trong màng và khả năng loại bỏ các hợp chất nitơ trong nƣớc. Khi các vi khuẩn này đƣợc cố định trên các giá thể nhờ màng sinh sẽ tăng khả năng sống sót của chúng và tăng khả năng sinh trƣởng. Điều này cũng đồng nghĩa với việc tăng khả năng loại bỏ các hợp chất chứa nitơ. Màng sinh còn giúp các vi khuẩn nitrate tồn tại đƣợc trong môi trƣờng có nồng độ amoni, nitrite hay nitrate cao.
1.5. Phân loại vi khuẩn bằng xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA
Ribosome là những hạt nhỏ hình cầu có kích thƣớc khoảng 20-35 nm, là nơi sinh tổng hợp protein của tế bào, các RNA ribosome chiếm khoảng 80-90% RNA của tế bào. Hiện nay các nhà khoa học cho rằng mức độ giống nhau về trình tự 16S rRNA phản ánh khoảng cách quan hệ giữa các cá thể vì cấu trúc của RNA ribosom chịu những áp lực rất lớn – hệ quả cần thiết để nó có cấu trúc bậc hai chính xác và tác động qua lại với các protein khác nhau tạo ra các ribosome chức năng. Tần số thay đổi của trình tự gen 16S rRNA ít hơn so với hệ gen và dựa trên trình tự này có thể xác định quan hệ họ hàng giữa các cá thể.
Woese đƣợc coi là ngƣời đi tiên phong trong việc sử dụng trình tự RNA ribosome để khảo sát quan hệ tiến hóa ở vi khuẩn. Theo Woese, trật tự nucleotide 16S rRNA là một chỉ số quan trọng trong xác định mối quan hệ chủng loại phát sinh giữa các nhóm vi khuẩn [54]. Đồng thời trình tự gen 16S rRNA của vi sinh vật trong ngân hàng gen quốc tế khá nhiều và phong phú. Chính vì vậy, phƣơng pháp giải trình tự gen 16S rRNA là phƣơng pháp phân tử phổ biến đƣợc dùng để định loại vi khuẩn.
Từ những năm 80, Woese và cộng sự lần đầu tiên sử dụng phƣơng pháp giải trình tự gen 16S rRNA trong nghiên cứu định loại vi khuẩn AOB. Vi khuẩn oxy hóa amoni đƣợc chia thành hai phân nhóm đồng nhất kiểu hình
β- và γ- proteobacteria . Ngày nay, trình tự gen 16S rRNA đầy đủ của 14 loài AOB thuộc lớp β-proteobacteria đã đƣợc mô tả có thể làm dữ liệu để chứng minh cho sự tiến hóa của nhóm [18], [49].
Việc định loại vi khuẩn oxy hóa amoni bằng cách so sánh trình tự 16S rRNA cho một cách nhìn tổng quan về phát sinh loài. Các nghiên cứu về gen chức năng đƣợc khẳng định hơn vị trí của các loài vi khuẩn nói chung và vi khuẩn nitrate hóa nói riêng trong cây phát sinh chủng loại.
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc