Nessler [25]
Nguyên tắc
Trong môi trƣờng bazơ mạnh NH4+
sẽ biến thành NH3. NH3 mới hình thành và NH3 sẵn có trong mẫu nƣớc sẽ tác dụng với phức chất Indo mercurate kalium (K2HgI4), hình thành phức chất có màu vàng nâu, cƣờng độ màu đậm hay nhạt tùy thuộc vào hàm lƣợng NH3 có trong mẫu nƣớc.
2 K2HgI4 + NH3 + 3KOH = Hg(HgIONH2) + 7KI + 2 H2O
(màu vàng)
K2HgI4 + NH3 + KOH = Hg(HgI3NH2) + 5KI + H2O (màu nâu) Tiến hành
Pha hóa chất
- Dung dịch Nessler
Trộn 10 gam KI trong 10 ml nƣớc, thêm từng ít một vừa cho vừa khuấy đều để dung dịch bão hòa đến khi xuất hiện kết tủa đỏ bền. Hòa tan 30 gam KOH, sau đó bổ sung 10 ml dung dịch HgCl2 bão hòa, thêm nƣớc đủ 200 ml, để qua đêm và gạn lắng lấy phần nƣớc trong. Bảo quản trong chai thủy tinh màu da cam có nút màu.
- Dung dịch gốc NH4+
Hòa 29,7 gam NH4Cl vào nƣớc cất, sau đó thêm nƣớc cất cho vừa đủ 1000 ml (2,97% NH4Cl ≈ 10mg NH4+
/ml).
Pha loãng dung dịch gốc 100 lần, lấy 1ml dung dịch gốc với 99 ml nƣớc cất. Vậy hàm lƣợng NH4+
trong dung dịch chuẩn pha loãng là 0,1 mg NH4+/ml. Tùy thuộc vào nồng độ đƣợc chọn làm chuẩn mà ta tiếp tục pha loãng theo các tỉ lệ khác nhau.
Bảng 2.1. Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn NH4+ với nƣớc cất
Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn với nƣớc cất (ml/ml) Hàm lƣợng N-NH4+ trong dung dịch pha loãng (mg/l) 0,05 +4,95 1 0,1 + 4,9 2 0,15 + 4,85 3 0,2 + 4,8 4 0,25 + 4,75 5 5 0 Xử lý mẫu
- Khử tạp chất: Cho vào bình tam giác (V=250 ml) 100ml dung dịch mẫu nghiên cứu, thêm 1ml ZnSO4 10%, lắc đều, thêm 0,4-0,5 ml dung dịch NaOH 6N sao cho pH của dung dịch đạt 10,5. Để lắng vài phút sau đó lọc qua giấy lọc không amoni.
- Phản ứng tạo màu của dung dịch nghiên cứu: Cho 25ml dung dịch mẫu (hoặc một phần dung dịch mẫu đƣợc pha loãng với nƣớc cất không amon với nồng độ thích hợp) vào bình 50ml. Thêm lần lƣợt các dung dịch sau vào dung dịch mẫu: 1ml dung dịch phenol, 1ml dung dịch sodium nitroprusside, 2,5ml dung dịch oxy hóa, lắc đều. Đậy bình bằng nắp nhựa hoặc màng paraphin, để yên mẫu ở nhiệt độ phòng 22 - 27oC trong 1 giờ. Nếu trong dung dịch tồn tại NH4+ thì nó sẽ phản ứng tạo màu xanh đậm. Cƣờng độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ NH4+
. Xác định hàm lƣợng NH4+ bằng phƣơng pháp soi màu trên máy quang phổ kế.
Đo độ hấp thụ màu của dung dịch nghiên cứu và dung dịch chuẩn trên máy quang phổ bƣớc sóng 420 nm. Hàm lƣợng NH4+
trong dung dịch nghiên cứu đƣợc tính theo công thức:
mg NH4/L = x Độ pha loãng.
2.3.3. Xác định hàm lƣợng NO2- bằng phƣơng pháp Griss [25]
Hàm lƣợng NO2- đƣợc xác định dựa trên phản ứng tạo màu hồng của NO2- với thuốc thử Griss.
Cách pha hóa chất
- Griss 1: Axit sunfanilic 8g Axit axetic 5N 1000ml
Hòa tan axit sunfamilic vào axit axetic 5N (nếu cần có thể đun nhẹ). Bảo quản trong lọ có nút.
- Griss 2: α- naphtylamin 0,51g Axit axetic 5N 30 ml Nƣớc cất 10ml
Hòa tan α- naphtylamin vào nƣớc cất, sau đó thêm vào axit axetic 5N. Bảo quản trong tủ lạnh.
- Pha dung dịch NO2- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch gốc: (0,075% NaNO2 ≈ 0,5 mg/ml NO2-
) Hòa tan 0,75g NaNO2 vào1000 ml nƣớc cất.
Dung dịch chuẩn pha loãng: Pha loãng dung dịch gốc 100 lần. Khi đó hàm lƣợng NaNO2 trong dung dịch pha loãng sẽ là 0,0075mg NaNO2/ml = 0,005 mg NO2-/ml. Tuỳ thuộc vào nồng độ đƣợc chọn làm chuẩn mà ta tiếp tục pha loãng theo các tỉ lệ sau.
Bảng 2.2. Tỷ lệ pha loãng dung dịch chuẩn + nƣớc cất và hàm lƣợng N-NO2 -
Tỷ lệ pha loãng dung dịch chuẩn +
nƣớc cất (mg/l) Hàm lƣợng N-NO2 - (mg/l) 0+50 0 1+49 0,1 2+48 0,2 3+47 0,3 4+46 0,4 5+45 0,5
- kiểm chứng 0,05 ml Griss 1 0,05 ml Griss 2 5ml
dung dịch chuẩn gốc pha loãng
- Mẫu nghiên cứu 0,05 ml Griss 1 0,05 ml Griss 2 5 ml dung dịch nghiên cứu (pha loãng nếu cần)
Lắc đều hỗn hợp trên và để yên trong 15 phút. Nếu dung dịch c NO2- sẽ màu hồng với thuốc thử. Cƣờng độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ NO2- có trong dung dịch. Đo độ hấp thụ của phản ứng màu của dung dịch nghiên cứu và dung dịch chuẩn trên máy đo quang phổ kế ở bƣớc sóng 520 nm. Hàm lƣợng NO2- trong dung dịch mẫu đƣợc tính bằng công thức sau:
mg NO2/L = x Độ pha loãng
2.3.4. Xác định hàm lƣợng NO3- -
bằng phƣơng pháp Salicylate [25]
- Chuẩn bị hóa chất: Natri salisilat 0,5%; H2SO4 98%; NaOH 30%; NaOH 2,5%;.
- Chuẩn bị dung dịch gốc NaNO3: Hòa tan 0,822 g NaNO3 vào nƣớc cất, thêm nƣớc cất vào cho vừa đủ 1000ml. Khi đó dung dịch gốc có nồng độ là 0,0822% NaNO3 ≈ 0,6mg N-NO3-/ml.
Pha loãng dung dịch chuẩn: Dung dịch gốc đƣợc pha loãng 100 lần. Khi đó hàm lƣợng NaNO3 trong dịch pha loãng sẽ là 8,22 mg NaNO3/l ≈ 6 mg NO3-/l.
Bảng 2.3. Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn + nƣớc cất và hàm lƣợng N-NO3- Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn + nƣớc
cất (ml) Hàm lƣợng N-NO3 - (mg/l) 0+120 0 20+100 1 40+80 2 60+60 3 80+40 4 100+20 5
- Cách tiến hành: Lấy 10ml mẫu chuẩn cho vào cốc đốt (cốc sứ, v = 25ml). Thêm 1ml dung dịch natri salisilat 0,5%. Đun nhẹ cho đến khi cạn và để nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm 1ml H2SO4 98%, để nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm 8ml nƣớc cất, để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 7 ml NaOH 30% và 9 ml NaOH 2,5%.
Nếutrong dung dịch có NO3-
sẽ xuất hiện màu vàng chanh. Cƣờng độ màu tỷ lệ thuận với hàm lƣợng NO3-
trong dung dịch. Mẫu chuẩn đƣợc tiến hành tƣơng tự. Sau 20 phút đo mẫu chuẩn và mẫu nghiên cứu ở bƣớc sóng 420 nm. Hàm lƣợng NO3-
đƣợc tính theo công thức sau:
mg NO3/L = x Độ pha loãng
2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá khả năng tạo màng sinh của các chủng
vi [39]
Các chủng vi khuẩn lựa chọn đƣợc nuôi lắc (200 vòng/phút) riêng rẽ trong ống nghiệm chứa 10ml môi trƣờng Winogradsky I (hoặc Winogradsky II) tại tủ lắc ổn nhiệt ở 30o
Sau 3 ngày nuôi cấy, hút 1ml dịch vi khuẩn vào ống eppendorf đã khử trùng và ủ trong tủ lắc ổn nhiệt ở 30oC, tốc độ 200 vòng/phút.
Sau 3 ngày tiếp theo, dịch nuôi cấy đƣợc chuyển sang ống eppendorf khác để xác định mật độ tế bào bằng cách đo mật độ quang học ở λ = 600 (OD600).
Phƣơng pháp quan sát khả năng tạo màng sinh : Ống eppendorf (chứa dịch vi khuẩn đã nuôi cấy ở trên) đƣợc rửa sạch 2 lần bằng nƣớc cất khử trùng. Sau đó mỗi ống eppendorf đƣợc bổ sung 1ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó đƣợc loại bỏ, rửa sạch 2 lần bằng nƣớc cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đánh giá khả năng tạo màng sinh của vi khuẩn nghiên cứu: Ống eppendorf sau khi bắt màu tím kết tinh đƣợc tráng bằng nƣớc cất 2 lần, các tinh thể tím bám vào thành eppendorf đƣợc hòa tan trong 1ml etanol 70o, đo độ hấp thụ dịch này ở λ = 570 nm trên máy quang phổ kế. Sự hình thành màng sinh vật tỷ lệ thuận với chỉ số OD570 tạo thành.
2.3.6. Ảnh hƣởng của một số điều kiện lên khả năng tạo màng sinh học và hoạt tính nitrate hóa hoạt tính nitrate hóa
2.3.6.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ đƣợc chọn nghiên cứu là 10o
C, 25oC, 30oC, 37oC và 40oC. Cách tiến hành: Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập đƣợc nuôi cấy lắc trong các ống nghiệm chứa 10ml môi trƣờng lỏng Winogradsky I (hoặc Winogradky II) ở tủ ổn nhiệt tƣơng ứng với các nhiệt độ 10oC, 25oC, 30oC, 37oC, 40oC và tốc độ lắc 200 vòng/phút. Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành chuyển sang ống eppendorf để thử khả năng tạo màng. Sau 6 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật.
2.3.6.2. Ảnh hƣởng của pH
Các giá trị pH khác nhau đƣợc lựa chọn nghiên cứu là: pH 4; 6; 7; 8 và 10. Để thay đổi pH ban đầu, sử dụng dung dịch H2SO4 2N và NaHCO3 15%.
Cách tiến hành: Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập đƣợc nuôi lắc (200v/ph) trong các ống nghiệm chứa 10ml môi trƣờng Winograsky I (hoặc Winograsky II) với các giá trị pH tƣơng ứng là 4; 6; 7; 8 và 10 ở 30oC. Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành chuyển sang ống eppendorf để thử khả năng tạo màng. Sau 6 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá hoạt tính và khả năng tạo màng của các chủng vi sinh vật nghiên cứu.
2.3.6.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng N-NH4+
(đối với vi khuẩn oxy hóa
amoni) và hàm lƣợng N- NO2
-
(đối với vi khuẩn oxy hóa nitrite)
Bổ sung hàm lƣợng N-NH4+
(hoặc N-NO2-) khác nhau vào môi trƣờng nuôi cấy tƣơng ứng đối với vi khuẩn oxy hóa amoni hoặc vi khuẩn oxy hóa nitrite: 5mg/l, 10mg/l, 100mg/l, 200mg/l, 500mg/l và 1000mg/l.
Cách tiến hành: Các chủng vi khuẩn lựa chọn, đƣợc nuôi lắc (200v/ph) trong các ống nghiệm chứa 10ml môi trƣờng Winograsky I (hoặc Winogradsky II) có hàm lƣợng N-NH4+ (hoặc N-NO2-) . Sau 3 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, tiến hành chuyển sang ống eppendorp để thử khả năng tạo màng. Sau 6 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, tiến hành quan sát, đánh giá hoạt tính và khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn nghiên cứu.
2.3.6.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng NaCl
Muối NaCl đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn với các hàm lƣợng khác nhau: 0mM; 100mM; 200mM; 300mM; 400mM.
Cách tiến hành: các chủng vi khuẩn nghiên cứu đƣợc nuôi cấy lắc (200v/ph) trong ống nghiệm chứa 10ml môi trƣờng Winogradsky I (hoặc
Winogradsky II) với các hàm lƣợng muối khác nhau 0mM; 100mM; 200mM; 300mM; 400mM. Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thử khả năng tạo màng. Sau 6 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá hoạt tính và khả năng tạo màng của các chủng vi sinh vật nghiên cứu.
2.3.7. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.3.7.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 2.3.7.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số
Vi khuẩn nitrate hóa đƣợc nuôi cấy trong 10ml môi trƣờng Winogradsky I (hoặc Winogradsky II) chứa 10 mg/l N trong điều kiện pH 7,5; nuôi lắc 200 v/ph ở 28±2˚C, sau 5 ngày nuôi cấy tiến hành tách chiết DNA genom của chúng theo các bƣớc sau: Dịch nuôi cấy đƣợc chuyển vào ống eppendoft 2 ml, ly tâm 8000 v/ph trong 5phút thu sinh khối của tế bào. Bổ sung thêm 540 μl extraction buffer và 5 μl proteazek 20 mg/ml đảo nhẹ nhàng sau đó ủ ở 37˚C trong 1,5 giờ. Bổ sung 60 μl SDS 20% ủ ở 65˚C trong 2giờ. Sau đó bổ sung chloroform : izoamyl alcohol tỉ lệ 24:1 với thể tích 1:1 (VD: 600 μl mẫu thì bổ sung 600 μl chloroform : izoamyl alcohol). Đem dịch li tâm ở 12000 v/ph ở 4˚C trong 15 phút để loại bỏ protein thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft mới. Trong trƣờng hợp dịch thu đƣợc chƣa sạch nghĩa là đang còn nhớt ta lặp lại đến khi hết nhớt thì thôi. Sau đó bổ sung izopropanol theo tỉ lệ 1:1 để ở nhiệt độ phòng 1giờ rồi li tâm 12000 v/ph trong 15 phút bỏ dịch thu tủa. Tủa là DNA genom đƣợc thu lại. Rửa tủa bằng ethanol 70% và đƣợc làm khô bằng máy hút chân không. Cuối cùng bổ sung 25 μl nƣớc khử ion để ở nhiệt độ phòng để làm tan hoàn toàn DNA sau đó bảo quản trong tủ lạnh.
2.3.7.2. Kỹ thuật PCR
Phản ứng chuỗi polymerase dựa trên nguyên tắc khuếch đại đoạn gen DNA đặc biệt trong điều kiện in vitro nhờ cặp mồi đặc trƣng. Cách tiến hành nhƣ sau: Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với tổng thể tích cuối là 25 μl chứa các thành phần: 2,5 μl buffer 10X; 2,5 μl dNTPs 2,5mM; 3μl MgCl2 10mM;
1μl mồi 16Sf; 1μl mồi 16Sr; 0,3μl Tag-DNA polymerase 1U/μl; 11,7 μl dH2O.
Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng PCR: i). 94oC/ 4 phút; ii). 94oC/ 1 phút; iii). 56oC/ 1 phút; iv). 72oC/ 1 phút 20 giây; v). 72oC/ 8 phút; vi). 8˚C-∞. Từ bƣớc 2-4 lặp lại 32 chu kì.
2.3.7.3. Điện di trên gel agarose
Các đoạn gen có kích thƣớc và điện tích khác nhau đƣợc tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng của máy điện di trong điện trƣờng có điện thế và cƣờng độ thích hợp. Quy trình tiến hành điện di nhƣ sau: gel agarose 0,8-1% đƣợc chuẩn bị; mẫu DNA đƣợc trộn với 1μl đệm tra mẫu và đƣợc tra vào các giếng nhỏ trên gel, chạy điện di (80-100V; 350-400mA) với chỉ thỉ phân tử DNA chuẩn để xác định trọng lƣợng phân tử, quan sát sự di chuyển màu để ngừng quá trình điện di (khoảng 30-35 phút); bản gel đƣợc lấy ra khỏi khuôn và đƣợc ngâm trong dung dịch EtBr 0,5μl/ml trên máy lắc trong 10 phút; bản gel đƣợc rửa bằng H2O, quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA và chụp ảnh.
2.3.7.4. Xác định và xử lý trình tự nucleotit của gen
Trình tự DNA đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Sanger và đtg trên máy trình tự từ DNA tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosytems) với bộ kit xác định trình tự BigDye Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystem. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sử dụng các phần mềm Bioedit, BLAST và CLC sequence Viewer để xử lí và so sánh trình tự nhận đƣợc với các trình tự gen 16S rRNA khác trong ngân hàng gen Quốc tế.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn nitrate hóa chủng vi khuẩn nitrate hóa
3.1.1. Phân lập
Mẫu nƣớc thải thu từ hệ xử lý nƣớc hồ Trúc Bạch và nƣớc thải làng bún Phú Đô đƣợc làm giàu bùn nitrate hóa. Sau hai tuần làm giàu các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập trên môi trƣờng thạch Winogradsky I và II. Sau 7 ngày ủ ở 30oC, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
Tập đoàn vi khuẩn thu từ hệ xử lý nước hồ Trúc Bạch được phân lập trên môi trường Winogradsky I (A) và Winogradsky II (C).
A C
Tập đoàn vi khuẩn thu từ nước thải làng bún Phú Đô được phân lập trên môi trường Winogradsky I (B) và Winogradsky II (D).
B D
Hình 3.1. Các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trƣờng Winogradsky.
N đƣợc chọn nuôi riêng và
làm sạch. , chúng tôi đã phân lập đƣợc 16 chủng vi khuẩn, trong đó 9 chủng trên môi trƣờng Winogradsky I (đặt tên là: NLI-1, NLI-2, NLI-3, NLI-4, NLI-5, NLI-6, NLI-7, PD58, PD60) và 7 chủng sinh trƣởng trên môi trƣờng Winogradsky II (đặt tên là: NLII-1, NLII-2, NLII-3, NLII-4, NLII-8, 5NM, 2NM)
Winogradskyi oxy hóa amoni
II nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite.
không, chúng tôi .
3.1.2.Khả năng nitrate hóa và tạo màng sinh học (Biofilm) 3.1.2.1. Vi khuẩn oxy hóa amoni
Xác định hoạt tính oxy hóa amoni
(tốc độ 200 vòng/phút) với
nồng độ NH4-N ban đầu là 5 mg/l trong điều kiện pH = 7,8, nhiệt độ 28±20C.