THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME ΒGALACTOSIDASE TỪ ASPERGILLUS ORYZAE VÀ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  TIỂU LUẬN: CÔNG NGHỆ ENZYME ĐỀ TÀI: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME Β-GALACTOSIDASE TỪ ASPERGILLUS ORYZAE VÀ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS Nhóm thực : 01 Giảng viên hướng dẫn : TS Hoàng Hải Hà Hà Nội - 2021 DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM Họ tên Mã sinh viên Lớp Hoàng Thị Ánh 636306 K63CNTPA Tống Hoàng Hà 636010 K63CNSTHA Hà Ngọc Hiếu 646064 K64CNTPD MỤC LỤC PHẦN THỨ NHẤT: TỔNG QUAN CHUNG VỀ ENZYME Β-GALACTOSIDASE I.1 Giới thiệu enzyme β-galactosidase β-galactosidase (β-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.23) hay gọi enzyme lactase β-galactosidase enzyme có khả xúc tác cho hai kiểu phản ứng: phản ứng thủy phân phản ứng chuyển gốc galactozyl Phản ứng thủy phân β-galactosidase thủy phân đường đơi lactose thành hai đường đơn glucose galactose, số trường hợp enzyme tham gia phản ứng transgalactosylation chuyển gốc galactose đến chất lactose tạo galacto - oligosaccharides (GOS) (Davail cs, 1994) I.2 Nguồn thu nhận enzyme β-galactosidase β-galactosidase phân bố rộng rãi tự nhiên thu từ nhiều nguồn khác thực vật (hạnh, đào, mơ, táo) từ nội tạng động vật, loại nấm men, vi khuẩn hay nấm sợi (Mlichová, Z – Rosenberg, M 2006) Nguồn enzyme từ động vật thực vật khó để triển khai theo quy mơ cơng nghiệp hạn chế sinh lí hạn chế kĩ thuật Vì có ưu điểm mà vi sinh vật chọn để sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp Theo (Nguyễn Đức Lượng cs, 2004), ưu điểm là: (1) Tốc độ sinh sản vi sinh vật mạnh Trong thời gian ni cấy ngắn, ta thu lượng sinh khối gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối động vật thực vật Để đạt tốc độ tăng sinh khối lớn vậy, vi sinh vật phải chuyển hóa khối lượng chất lớn Cũng từ nghiên cứu E coli, nhiều nhà khoa học cho thấy vịng 24 giờ, vi khuẩn E coli chuyển hóa khối lượng chất lớn ngàn lần khối lượng thể chúng Để chuyển hóa khối lượng chất lớn vậy, chúng phải tổng hợp lượng enzyme lớn Bởi vì, chuyển hóa chất tế bào enzyme đảm nhận Chính thế, sử dụng vi sinh vật nguồn sinh học để sản xuất enzyme có lợi Trong khoảng thời gian ngắn, ta thu lượng sinh khối lớn (để thu enzyme nội bào) mà thu lượng enzyme ngoại bào vừa nhiều, vừa có hoạt tính riêng cao (2) Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao Ưu điểm gắn liền với tốc độ chuyển hóa chất gắn liền với tốc độ sinh sản phát triển vi sinh vật (3) Vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp Trong sản xuất này, trình sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật hồn tồn khơng phụ thuộc vào khí hậu bên ngồi sản xuất enzyme từ nguồn thực vật động vật (4) Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền dễ kiếm Đây lợi quan trọng Nhờ đó, ta làm giảm giá thành sản phẩm sản xuất nơi giới Tính chất, tính đặc hiệu hay cấu trúc không gian enzyme β-galactosidase tương đối khác ví dụ độ dài chuỗi amino acid, pH tối ưu nhiệt độ tối ưu phân lập từ nguồn khác Lựa chọn phù hợp nguồn sản xuất β-galactosidase phụ thuộc vào q trình thủy phân lactose Ví dụ nguồn nấm men có pH tối ưu từ 6,5-7,0 sử dụng cho sản phẩm sữa hay whey Hay nguồn nấm sợi có pH tối ưu từ 3-5 phù hợp với whey có tính acid Ngồi ra, khả hoạt động enzyme β-galactosidase phụ thuộc vào ion Kluyveromyces lactics yêu cầu ion Mn2+, Na+ hay Kluyveromyces fragilis yêu cầu ion Mn2+, Mg2+, K+ Nguồn Nấm sợi Nấm men Aspergillus niger Aspergillus oryzae Sản phẩm enzyme pH tối ưu Ngoại bào Kluyveromyces lactis Nội bào Kluyveromyces fragilis Escherichia coli Vi khuẩn Lactobacillus thermophilus Nội bào Leuconostoc citrovorum Bacillus circulans Nhiệt độ tối ưu (°C) 3,0 - 4,0 55 - 60 5,0 50 - 55 6,5 - 7,0 30 - 35 6,6 30 - 35 7,2 40 6,2 55 6,5 66 6,0 65 (Mlichová, Z – Rosenberg, M 2006) PHẦN THỨ 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Β-GALACTOSIDASE Enzyme β-galactosidase có vai trị quan trọng công nghiệp chế biến thực phẩm, βgalactosidase ứng dụng phổ biến cho trình thủy phân lactose công nghiệp chế biến sữa, sản phẩm từ sữa sản xuất galactose-oligosaccharides dược phẩm 2.1 Thủy phân lactose sản xuất sữa sản phẩm từ sữa Enzyme β-galactosidase xúc tác cho trình thủy phân lactose thành phân tử đường glucose galactose, làm tăng độ sản phẩm khoảng 50% (Mlichová, Z – Rosenberg, M 2006) Quá trình thủy phân lactose enzyme β-galactosidase: Đây ứng dụng quan trọng β-galactosidase công nghiệp chế biến sữa hay để sản xuất sữa không chứa lactose (Harju, M., Kallioinen, H., & Tossavainen, O (2012) Trong sản phẩm sữa đặc hay kem, nồng độ lactose cao dẫn đến kết tinh lactose làm cho sản phẩm có sạn đường, sử dụng β-galactosidase làm ngăn tinh thể lactose kết tinh, nâng cao giá trị cảm quan cho sản phẩm Theo Parmjit S Panesar cs, 2006 thủy phân lactose tạo monosaccharides dễ dàng cho trình lên men hơn, giảm thời gian để bổ sung vi sinh vật nuôi cấy đạt pH mong muốn sản phẩm lên men phơ mai, sữa chua Do đó, lượng chất làm sữa chua giảm làm cho sản phẩm cuối có chứa calo 2.2 Sản xuất galactose-oligosaccharides Lactase tham gia vào trình chuyển hóa lactose thành galactose-oligosaccharides (GOS) GOS prebiotic ứng dụng sản phẩm dược phẩm có lợi sức khỏe người đặc biệt hệ tiêu hóa GOS giúp ổn định hệ vi sinh đường ruột, kết hợp với chủng vi sinh vật có lợi đường ruột làm tăng khả miễn dịch, Chu trình chuyển hóa Lactose thành galactose-oligosaccharides tác dụng enzyme: PHẦN THỨ 3: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME Β-GALACTOSIDASE 3.1 Thu nhận tinh enzyme β-galactosidase từ Lactobacillus acidophilus 3.1.1 Nguyên vật liệu Chủng giống Lactobacillus acidophilus lấy giống từ môn công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh Lactobacillus acidophilus ni cấy mơi trường MRS thạch nghiêng agar, 4°C 3.1.2 Thu sinh khối vi sinh vật enzyme thô Nguyễn Thị Vân Linh cộng tiến hành nuôi cấy môi trường cảm ứng sinh βgalactosidase bao gồm: lactose (10 g/l), cao nấm men (60 g/l), cao thịt (10 g/l), Tween 80 (6 g/l), K2HPO4 (3 g/l), KH2PO4 (1 g/l), CH3COONa (3 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), MnSO4(0,15 g/l) Quá trình lên men thực erlen 500 ml, 37°C, pH 6,0, tốc độ lắc 100 vòng/phút 50 Kết thúc trình lên men, ly tâm canh trường 5000 vòng/phút 15 phút, 4°C thu nhận sinh khối Rửa sinh khối hai lần dung dịch đệm sodium phosphate 0,05M, pH 7,0 Bảo quản sinh khối -20°C cần sử dụng Để thu nhận β-galactosidase, tế bào vi khuẩn phá vỡ phương pháp xử lý sóng siêu âm dịch huyền phù vi sinh vật 5% w/v đệm sodium phosphate pH 7,0, công suất siêu âm 396kW, thời gian siêu âm 3,2 phút Dịch huyền phù sau xử lý sóng siêu âm đem ly tâm 6000 vòng/phút, 4°C, 15 phút, để thu dịch enzyme thô 3.1.3 Tinh enzyme Tiến hành thu protein enzyme muối (NH4)2SO4 nồng độ (w/v) 25,1%; 31,4%; 39%; 47,2%; 56,1%; 65,7%; 76,1%, NaCl nồng độ (w/v) 15%, 20%, 25%, 30% 35% dung môi hữu (ethanol, isopropanol, aceton) với tỷ lệ thể tích dung mơi thể tích dịch enzyme lần lượt: 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15 90:10 Đánh giá tác nhân kết tủa protein enzyme hiệu Hiệu suất thu hồi độ tinh enzyme dung môi isopropanol cao với hiệu suất thu hồi 89,93% độ tinh 4,5 lần Nhóm tác giả lựa chọn dung môi isopropanol làm tác nhân kết tủa Kết tủa enzyme thơ sau đưa tinh sắc ký lọc gel Enzyme thô đem tinh hệ thống sắc ký lọc gel (GPC - Algilent 1100series) sử dụng cột Ultrahydrogel 250 Cột cân rửa giải dung dịch đệm sodium phosphate 0,05M, pH 7,0 Tốc độ dòng 1ml/phút, áp lực bơm 41 bar Thu nhận phân đoạn xác định hoạt tính β-galactosidase Thời gian lọc gel diễn 18 phút thu phân đoạn enzyme có phân đoạn enzyme thu từ 6-8 phút có hoạt tính β-galactosidase, phân đoạn cịn lại khơng có hoạt tính Sau sắc ký lọc gel hiệu suất thu hồi enzyme 58,57%, độ tinh tăng 22,6 lần so với enzyme sau phá vỡ tế bào 3.1.4 Đánh giá nhiệt độ, pH tối ưu, số động học enzyme β-galactosidase a Nguyên tắc Nguyên tắc: Hoạt tính β-galactosidase xác định cách cho enzyme phản ứng với chất tổng hợp o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (oNPG) Dưới tác dụng βgalactosidase, oNPG thủy phân thành galactose o-nitrophenol o-nitrophenol giải phóng chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng hấp thụ (Abs) bước sóng cực đại 420 nm Một đơn vị hoạt tính định nghĩa lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1μmol oNP (onitropheny) phút điều kiện thích hợp Hoạt tính enzyme 1ml dịch ni cấy tính theo cơng thức sau: Trong đó: U/ml: Hoạt tính β- galactosidase Abs420nm: Độ hấp thụ quang phản ứng màu đo 420 nm Blank: Độ hấp thụ quang mẫu đối chứng SlopeoNPstandardcurve: Hệ số góc đường chuẩn oNP treaction: Thời gian phản ứng enzyme chất (phút) (TS Nguyễn Hoàng Anh, 2018) b Đánh giá nhiệt độ, pH tối ưu enzyme, xác định số động học enzyme Nguyễn Thị Vân Linh cộng tiến hành chuẩn bị chất ONPG (ortho-nitrophenyl-βD-galctopyranoside) với nồng độ 3mM dung dịch đệm sodium phosphate 0,05M, pH 7,0 Nhiệt độ đánh giá từ 30 - 70°C xác định hoạt tính enzyme Từ kết quả, tác giả xác định nhiệt độ tối ưu enzyme đạt cao 40°C bắt đầu giảm mạnh 60 - 70°C Trên 70°C enzyme vơ hoạt hồn tồn Đánh giá pH tối ưu enzyme, tiếp tục sử dụng chất ONPG với nồng độ 3mM, thay đổi pH môi trường phản ứng từ – sử dụng dung dịch đệm là: acetate 0,05M, pH – 4,5; phosphate 0,05M, pH – 8, borate, pH 8,5 – 10 Nguyễn Thị Vân Linh cộng xác định pH tối ưu enzyme khoảng – 7,5 Ở pH = 6,5 hoạt tính enzyme cao (90%) pH 4,5 hoạt tính enzyme không đáng kể Nguyễn Thị Vân Linh cs sử dụng ONPG làm chất phản ứng, nồng độ chất thay đổi từ 0,6 mM – 5,4 mM Hằng số động học V max Km tính tốn từ phương trình Lineweaver – Burk giá trị Vmax Km 2,3 µmol/phút 0,73 mM 3.2 Thu nhận tinh enzyme β-galactosidase từ Aspergillus oryzae 3.2.1 Nguyên vật liệu Chủng giống Aspergillus oryzae lấy từ nguồn giống sử dụng sản xuất công nghiệp α-amylase nuôi cấy thạch Sabouraud Thu sinh khối vi sinh vật Park cộng tiến hành nuôi cấy thu sinh khối Aspergillus oryzae môi trường: 3.2.2 4% tinh bột khoai tây, 1.5% peptone, 1.0% yeast extract, 1.0% KH 2PO4, and 0.2% NaNO3, pH 5.5 erlen 500 ml Ủ 30°C với tốc độ lắc 250 vòng/phút ngày Sau kết thúc trình lên men, sinh khối lọc thu dịch ethanol nồng độ thể tích 70% 4°C 3.2.3 Tinh enzyme 11 Park cộng tiến hành thu protein enzyme thơ phịng lạnh 4°C Thêm 560 g (NH4)2SO4 vào dịch lọc lên men (80% bão hịa) Kết tủa hình thành sau để qua đêm lắng lực li tâm 20000 x G thời gian 10 phút Kết tủa làm 100ml nước khử ion Sau kết tủa thẩm tách dung dịch đệm sodium acetate 0,05M, pH 5,0 48h Tinh enzyme sắc ký cột DEAE-cellulose Protein enzyme tinh hệ thống sắc ký trao đổi ion dạng cột (4 x 50cm) với chu kì 1N NaOH 1N HCl cân với dung dịch đệm sodium acetate (0.05-0.6M), pH = 5, dòng chảy 5ml thời gian 30 phút Các phân đoạn chứa hoạt tính β-galactosidase kết tủa amoni sulfate Sau đó, kết tủa có chứa protein enzyme β-galactosidase thẩm tách dung dịch đệm 0,05M sodium acetate, pH = 48h β-galactosidase tinh chế tiếp tục thẩm tách sắc ký cột CMcellulose với cột quy trình tương tự sắc ký DEAE-cellulose với dung dịch đệm sodium acetate 0,05M, pH = Sau trình này, enzyme tinh sắc ký cột DEAE-Sephadex A50 (2x 50cm) quy trình tương tự DEAE-cellulose với dung dịch đệm sodium acetate 0,05M, pH = 12 Sau sử dụng amoni sulfate sắc ký DEAE-cellulose hoạt tính enzyme thu 40U/mg Trong trình sắc ký CM-cellulose tách phân đoạn không thủy phân pnitrophenyl-α-D-galactopyranoside thủy phân lactose, ONPG tinh bột Đó βgalactosidase α-amylase xuất phân đoạn Sau sắc ký DEAE-Sephadex A50 hoạt tính enzyme β-galactosidase thu 106U/mg 3.2.4 Đánh giá nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme, xác định số hoạt động enzyme Nguyên tắc đánh giá enzyme β-galactosidase tương tự mục 3.1.4.a Để xác định nhiệt độ tối ưu enzyme, Park cs sử dụng 4mM ONPG dung dịch đệm sodium acetate 0,1M, pH = Nhiệt độ đánh giá từ 30 - 70°C với enzyme thô enzyme tinh Từ kết quả, Park cộng xác định nhiệt độ tối ưu enzyme thô từ 55 - 60°C, nhiệt độ tối ưu enzyme tinh từ 50 - 55°C Enzyme thô bền với nhiệt so với enzyme tinh 13 Xác định pH tối ưu enzyme, sử dụng enzyme 4mM ONPG nhiệt độ 60°C, thay đổi dung dịch đệm tạo pH tương ứng Ở pH 3,6 - 5,6, dung dịch đệm 0,1M sodium acetate; 0,1M dung dịch đệm sodium phosphate cho pH 5,7 - 8,0 Enzyme β-galactosidase xác định pH tối ưu pH = Đánh giá độ bền pH enzyme β-galactosidase tinh chế nhiệt độ phòng, để qua đêm Sử dụng 60μg/ml dung dịch đệm: 0.05M acetate pH 3,6 – 5,6; 0.05M phosphate pH 5,7 – 8,0; 0.05M boric acid pH 8,2 – 9,2; NaOH pH 9,4 – 10,1 Kết cho thấy enzyme β-galactosidase khơng bị hoạt tính pH từ 3,6 đến điều kiện nhiệt độ phòng, qua đêm Đánh giá ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt tính enzyme, Park cộng tiến hành sử dụng ml chất ONPG, 0,5 ml enzyme tinh chế 1,5 ml ion kim loại tiến hành trộn lẫn nhiệt độ 60°C 15 phút 14 Các tác giả đánh giá khơng có ion kim loại ảnh hưởng đến khả hoạt động enzyme β-galactosidase Để xác định số hoạt động enzyme, Park cộng sử dụng ml chất ONPG lactose phản ứng với ml enzyme tinh ủ 60°C 15 phút V max Km tính tốn theo phương pháp Lineweaver – Burk Km enzyme từ Apergillus Oryzae xấp xỉ 0,77mM cho ONPG 50mM cho lactose Vmax enzyme 55,6 μg/phút/mg protein cho ONPG 2,46 μg/phút/mg protein cho sữa ONPG chất tốt để xúc tác xác định hoạt tính enzyme β-galactosidase TÀI LIỆU THAM KHẢO Zuzana Mlichová - Michal Rosenberg (2006) Current trends of β-galactosidase application in food technology, Journal of Food and Nutrition Research 2, 47-54 Harju, M., Kallioinen, H., & Tossavainen, O (2012) Lactose hydrolysis and other conversions in dairy products: Technological aspects, Int Dairy J, 22, 104-109 Parmjit S, P., Shweta, K., Reeba, P (2010) Protential Applications of Ininiobilized β-galactosidase in Food Prossesing Industries Enzyme Research Davail, S., Feller, G., Narinx, E., Gerday, C (1994) Cold adaptation of protein J Biol Chem, 269 Xavier, J R., Ramana, K V., & Sharma, R K (2018) β-galactosidase: Biotechnological applications in food processing Journal of Food Biochemistry Y K Park, M S S De Santi and G M Pastore (1979) Production and characterization of β -galactosidase from Aspergillus Oryzae Journal of Food Biochemistry 1, 100-103 Nguyễn Thị Vân Linh, Nguyễn Thị Thùy Dung, Trần Bích Lam (2012) Thu nhận tinh βgalactosidase từ Lactobacillus acidophilus Tạp chí phát triển KH&CN tập 15 15 TS Nguyễn Hoàng Anh (2018) Tuyển chọn, định danh vi khuẩn Bacillus an toàn thực phẩm sinh enzyme β-galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme 16