TIỂU LUẬN CUỐI kì môn DI TRUYỀN VI SINH vật tên CHỦ đề TRÌNH tự lặp lại có KHẢ NĂNG mã HOÁ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÀI TIỂU LUẬN CUỐI KÌ MƠN: DI TRUYỀN VI SINH VẬT TÊN CHỦ ĐỀ: TRÌNH TỰ LẶP LẠI CĨ KHẢ NĂNG MÃ HỐ GVHD: PGS.TS Phan Thị Phượng Trang Thành viên nhóm Trương Thị Kim Ngân Phan Thị Ngọc Hà Ý Khánh Nguyên Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng năm 2021 18150210 18150218 18150220 MỤC LỤC I Retrons vi khuẩn I.1 Lịch sử phát Retrons vi khuẩn I.2 Con đường sinh tổng hợp msDNA I.4 Chức sinh học msDNA II Locus CRISPR II.1 Cấu trúc điển hình locus CRISPR II.2 Nguồn gốc trình tự đệm 10 II.3 Hệ thống miễn dịch CRISPR 10 II.4 Sự hình thành đơn vị CRISPR 11 II.5 Mơ hình đơn giản hoá cho hoạt động CRISPR 13 II.6 Hoạt động Endoribonuclease protein Cas6 Pyrococcus furiosus 13 II.7 CRISPR cung cấp khả miễn dịch sinh vật nhân sơ .14 II.8 CRISPR- Cas9 – công cụ chỉnh sửa gene phổ biến .16 Tài liệu tham khảo .19 I Retrons vi khuẩn I.1 Lịch sử phát Retrons vi khuẩn Retrons trình tự DNA riêng biệt mã hố cho enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase, kí hiệu: RT) tương tự RT tạo retrovirus loại retroelements khác DNA Retron thường liên kết với DNA prophage tìm thấy gen nhiều loại vi khuẩn khác Retron RT sử dụng để tổng hợp DNA vệ tinh lạ gọi msDNA msDNA thực tế phức hợp DNA, RNA protein Nó cấu tạo DNA sợi đơn nhỏ , liên kết với phân tử RNA sợi đơn nhỏ Phần cuối 5’ phân tử DNA nối với phần dư guanosine bên phân tử RNA liên kết phosphodiester 2’ -5’ msDNA tạo với hàng trăm tế bào, chức chưa biết đến Mặc dù retrons khơng có gen hầu hết thành viên quần thể vi khuẩn có liên quan , retrons khơng hồn tồn DNA lành tính Các chứng bắt đầu cho thấy phần tử retron tạo tác động nhỏ có khả gây ảnh hưởng lớn đến tế bào chủ Điều bao gồm việc tạo lặp lại trình tự msDNA gen làm tăng tần số xuất đột biến Bởi kiện liên quan đến retron RT, điều đại diện cho nguồn phiên mã ngược tế bào vi khuẩn Do đó, q trình phiên mã ngược, lực ảnh hưởng đến nội dung cấu trúc hầu hết gen sinh vật nhân chuẩn , nguyên nhân dẫn đến thay đổi số gen nhân sơ.[1] msDNA phát lần vi khuẩn myxobacterium, Myxococcus xanthus tên viết tắt DNA sợi đơn đa chép (multi-copy single-stranded DNA) Thật vậy, phân tử msDNA tạo vi khuẩn , kí hiệu msDNA-Mx162, chứa phân tử DNA sợi đơn gồm 162 nucleotide có tới 500 đến 700 tạo tế bào Tuy nhiên, từ thí nghiệm đơn giản, chẳng hạn khơng ổn định phân tử đánh dấu 5’ tiếp xúc với natri hydroxit thay đổi tính linh động điện di phân tử sau xử lý với RNase, người ta nhanh chóng nhận RNA liên kết với msDNA Trên thực tế, ARN liên kết cộng hóa trị với phân tử ADN sợi đơn liên kết phosphodiester 2’-5’ nhất.[1] Một msDNA, định msDNA-Ec73, từ E.coli, mô cấu trúc nhánh bất thường msDNA cấu trúc bảo tồn khác phân tử vệ tinh (Hình 1) Đầu tiên, msDNA-Ec73 chứa chuỗi đơn DNA gồm 73 nucleotide gấp lại thành cấu trúc mạch vòng dài, ổn định Trong số hàng chục msDNA đặc trưng từ vi khuẩn, tất chứa DNA sợi đơn (từ 48 đến 165 nucleotide) cho gấp lại thành cấu trúc bậc hai ổn định Liên kết cộng hoá trị với đầu 5’ phân tử DNA sợi đơn RNA (trình tự đóng hộp Hình 1) Có nghĩa là, phần dư guanosine cụ thể sợi RNA, phân tử DNA nối với vị trí 2’ phần dư guanosine RNA Do đó, msDNA phân tử có chứa liên kết 2’ -5’ phosphodiester sợi RNA DNA Liên kết nhánh phân tử RNA xảy phần dư G cụ thể bên thường nằm trình tự AGC Cấu trúc bảo tồn cuối msDNA vùng ngắn bắt cặp sở đầu 3’ sợi DNA 3’ cuối chuỗi RNA (Hình 1) Ngồi cấu trúc thứ cấp bảo tồn này, trình tự nucleotide phân tử DNA RNA thường khác hai msDNA khác Có nhóm retrons liên quan tạo msDNA với số mức độ tương tự trình tự sơ cấp.[1] Hình Cấu trúc msDNA msDNA, ví dụ msDNA-Ec73, DNA có trọng lượng phân tử nhỏ (mũi tên màu trắng ảnh) dễ dàng quan sát sau điện di gel chiết xuất DNA plasmid từ E.coli MsDNA bao gồm phân tử RNA 76 nucleotide ( trình tự đóng hộp ) nối với phân tử DNA mạch đơn 73 nucleotide Đầu 5’ chuỗi DNA nối, thông qua liên kết 2’,5’ phosphodiester, với gốc guanosine cụ thể phân tử RNA (khoanh tròn G) Cả chuỗi RNA chuỗi DNA gấp lại thành cấu trúc mạch vòng ổn định Một số msDNA bị thay đổi (xử lý) sau chúng tổng hợp Ví dụ, khoảng 16 nucleotide cắt khỏi đoạn 5’ cuối chuỗi RNA msDNA-Mx162 từ M xanthus, dẫn đến dạng msDNA trưởng thành với phân tử RNA nhỏ Tương tự vậy, số msDNA, toàn chuỗi RNA bị loại bỏ (cũng nucleotide từ đầu 5’ phân tử DNA) phân cắt endonucleolytic đầu 5’ sợi DNA [1] Các cấu trúc thứ cấp bảo tồn msDNA, liên kết nhánh , vòng thân gấp khúc, vùng lai RNA-DNA diện cách thức tổng hợp msDNA Tuy nhiên, sau tổng hợp hoàn tất, số retrons, msDNA sửa đổi thêm Ví dụ, msDNA- Mx162 từ M xanthus ban đầu tổng hợp với phân tử RNA 77 base nối với phân tử DNA 162 base Tuy nhiên, dạng tiền thân sau chuyển đổi thành dạng msDNA trưởng thành nhỏ cách loại bỏ 16 nucleotide từ đầu 5’ chuỗi RNA Đối với số phần tử retron , trình xử lý sau sản xuất msDNA dẫn đến việc loại bỏ hoàn toàn toàn phân tử RNA bao gồm cấu trúc nhánh Ví dụ, trường hợp msDNA-Ec83 (từ E.coli), phân cắt endonucleolytic phân tử DNA nucleotide thứ tư thứ năm loại bỏ chuỗi RNA 84 base cộng với bốn deoxyribonucleotide tham gia vào đoạn G phân nhánh Điều dẫn đến msDNA trưởng thành bao gồm phân tử DNA sợi đơn Có số suy đốn msDNA có hoạt động tự xúc tác retron RT chịu trách nhiệm cho phân cắt phân tử DNA q trình xử lý Tuy nhiên, khơng rõ nguồn gốc hoạt động endonuclease Dường có nhóm yếu tố retron có liên quan đến phát sinh loài tạo msDNA trưởng thành, msDNA không mang RNA Chúng bao gồm Ec78 Ec83 từ E.coli, Vc 95 từ Vibrio cholerae St85 từ Salmonella typhimurium Các msDNA tạo retrons giống mức độ độ giống nucleotide sơ cấp phân tử DNA RNA chúng.[1] Một khía cạnh cuối cấu trúc msDNA msDNA ban đầu phát giống dải DNA vệ tinh nhỏ bật sau điện di gel tổng số DNA tách chiết từ tế bào M xanthus Tuy nhiên, tất khả msDNA tồn nhiễm sắc thể phức hợp nucleoprotein trọng lượng phân tử lớn bao gồm nhiều msDNA liên kết với thành phần protein Chắc chắn, retron RT protein liên kết với msDNA phức hợp Khi RT từ retronEc67 tinh chế, đồng phân đoạn với msDNA phức hợp trọng lượng phân tử lớn Các protein khác, tế bào chủ tạo ra, liên kết với phức hợp msDNA Ví dụ, RNase H tế bào chủ tạo liên kết với msDNA, thời gian ngắn, dường tham gia vào q trình tổng hợp msDNA Ngoài ra, protein sửa chữa khớp sai MutS, tế bào chủ tạo ra, nhận liên kết với msDNA [1] I.2 Con đường sinh tổng hợp msDNA msDNA cDNA, tạo cách phiên mã ngược , vùng ngắn khuôn mẫu mRNA Tuy nhiên, msDNA, phần khuôn mẫu RNA không phiên mã ngược liên kết với cDNA sau trình phiên mã ngược Liên kết 2’ -5’ msDNA tạo retron RT để bắt đầu tổng hợp cDNA Ở đây, nhóm 2’ -OH gốc guanosine đặc biệt khuôn mẫu RNA sử dụng để bắt đầu q trình tổng hợp cDNA Do đó, vùng mRNA mã hóa locus msr-msd đóng vai trị vừa đoạn mồi vừa khn mẫu để tổng hợp cDNA RT Trước tổng hợp msDNA bắt đầu phiên mã RNA vùng msr-msd DNA retron phải tạo để đóng vai trị mồi khn mẫu để phiên mã ngược RNA mẫu mồi có nguồn gốc từ phiên mã mRNA dài operon retron msr-msd-ret mơ tả trước Điều quan trọng để bắt đầu tổng hợp cDNA khả RNA mẫu để gấp thành cấu trúc thứ cấp cụ thể Cấu trúc thứ cấp cụ thể cho phép RNA khuôn mồi bắt đầu tổng hợp cDNA retron RT Gấp RNA phân tử trung gian cách bắt cặp bazơ nội phân tử hai trình tự lặp lại đảo ngược RNA, định a1 a2 Cấu trúc thân hình thành, với vòng cuống, dường liền kề với guanosine đặc biệt bên (được gọi phân nhánh G) RNA gấp lại để nhóm 2'-OH G phân nhánh đóng vai trị mồi để bắt đầu tổng hợp cDNA Retron RT nhận biết liên kết với cấu trúc vòng đặc hiệu RNA khuôn mẫu mồi với phân nhánh G định vị vị trí cuối cấu trúc thân a1-a2 Điều cho phép RT sử dụng 2'-OH phân nhánh G làm mồi để bắt đầu tổng hợp cDNA Sau hình thành liên kết 2'-5 'phosphodiester với deoxyribonucleotide (dNTP), việc kết hợp dNTPs theo hướng khuôn mẫu xảy theo cách thông thường để tiếp tục tổng hợp cDNA Kết hợp chặt chẽ với mở rộng phân tử cDNA việc loại bỏ khuôn mẫu RNA trễ nhờ hoạt động RNase H, dường cung cấp tế bào chủ Tại vị trí cụ thể RNA, trình trùng hợp khn mẫu cDNA q trình loại bỏ khuôn mẫu RNA qua trung gian RNase H dừng lại, dẫn đến phân tử msDNA hình thành Đó là, phân tử cDNA ngắn liên kết cộng hóa trị với phần cịn lại phân tử RNA đóng vai trị khn- mồi cho tổng hợp nó.[1] Hình Tổng hợp msDNA Sau phiên mã operon retron msr -msd-ret, phần nhỏ mRNA đóng vai trị khn mẫu mồi để tổng hợp cDNA vùng msd cách phiên mã ngược Việc gấp RNA thành cấu trúc bậc hai cho phép nhóm 2’-OH phần gốc G phân nhánh (G nằm I.4 Chức năngmột sinhvòng học trịn với nhóm 2’ -OH hiển thị msDNA đường ngắn) để dùng Chức củamột retrons mộtvẫn đoạn mồi để bắt msDNA hợp cDNA chưa xác đầu định tổng rõ retroncứuRT Sau tổng ràng Nhiều nghiên hợp cDNA retrons liên (đường đứt nét) hoàn tất, quan đến chế phòng vệ phần bảo vệ vi khuẩnkhuôn chốngmẫu lại RNA nối với phage đầu 5’ phân tử xâm nhiễm cDNA để tạo msDNA [10] [1] II Locus CRISPR Hệ thống CRISPR-Cas bao gồm trình tự lặp lại Palindromic ngắn xen kẽ thường xuyên protein Cas liên kết Hệ thống tồn sinh vật nhân sơ, khoảng nửa số vi khuẩn hầu hết vi khuẩn cổ Những trình tự hình thành từ đoạn DNA những thể thực khuẩn (bacteriophage) công vào sinh vật nhân sơ Chúng dùng để phát phá hủy DNA loại thực khuẩn tương tự lần công sau Do đó, chúng đóng vai trị quan trọng hệ thống phòng thủ sinh vật nhân sơ Định nghĩa chuỗi CRISPR phát năm 1987 E.coli Ishino cộng Qua quan sát thấy có 14 lần lặp 29 bp (base pair) xen kẽ với trình tự đệm (spacer) 32-33 bp khơng lặp lại nằm cạnh gene iap (isozyme-converting alkaline phosphatase) Năm 2005, nghiên cứu báo cáo spacer thường bao gồm plasmid DNA phage, cho CRISPR hệ thống phòng thủ chống lại DNA phage plasmid xâm nhập (hệ thống miễn dịch bắt buộc) Qua phân tích đánh giá, phát CRISPR tìm thấy xấp xỉ 40% trình tự gen vi khuẩn 90% trình tự gen vi khuẩn cổ II.1 Cấu trúc điển hình locus CRISPR Chuỗi CRISPR CAS gene tạo nên hệ thống CRISPR có tính đa dạng lồi vi sinh vật Kích thước đoạn repeat đa dạng từ 24-47 bp Kích thước đoạn spacer từ 26-72 bp Số lượng đoạn repeat chuỗi đa dạng từ đến 249 (được ghi nhận Verminephrobacter eiseniae) Nhiều gen bao gồm locus CRISPR đơn, riêng M.jannaschii có 18 locus Cuối cùng, vài hệ thống CRISPR có gene CAS hơn, hệ thống khác có tới 20 Repeat: Trong chuỗi đơn, đoạn repeat giống kích thước trình tự Mặc dù có đa dạng lồi, repeat hình thành nhóm, dựa tương đồng trình tự, chia thành 12 nhóm Một số nhóm lớn bao gồm đoạn palindrome (5-7 bp) Các trình tự palindrome dùng để tạo cấu trúc RNA thứ cấp stem-loop Giả thuyết ủng hộ nhờ diện đột biến đoạn repeat giúp trì cấu trúc quan sát thấy chuỗi repeat- spacer phiên mã thành RNA Spacer: Trong hệ thống CRISPPR nào, spacer thường nhất, ngoại trừ trường hợp xảy lặp đoạn spacer Qua so sánh tương dồng hệ thống CRISPR đa dạng, nhiều spacer thường có trình tự giống với phage yếu tố di truyền ngồi Leader: Một trình tự lên tới 550 bp có vị trí đầu 5’ hầu hết locus CRISPR, liên kết trực tiếp với đoạn repeat Trình tự kí hiệu ‘leader’ thường xuyên giàu AT Tương tự đoạn repeat, đoạn leader thiếu khung đọc mở (open reading frame) không bảo tồn loài Tuy nhiên, vài locus CRISPR tìm thấy nhiễm sắc thể giống có trình tự leader bảo tồn Một đơn vị repeat-spacer chèn vào đoạn leader đơn vị có trước, đoạn leader vùng nhận diện cho việc thêm đoạn spacer Đoạn leader đóng vai trị promoter cho trình phiên mã CRISPR CAS genes: Hệ thống CRISPR phân loại thành subtype (kiểu phụ), kiểu phụ bao gồm 2-6 CAS gene đặc hiệu khác Thêm vào đó, lõi CAS gen (Cas1-6) liên kết với nhiều subtype đa dạng Gene Cas1 (NCBI COGs database code: COG1518) đặc biệt đáng ý, hoạt động marker đánh dấu phổ biến hệ thống CRISPR (liên kết với tất hệ thống CRISPR, ngoại trừ Pyrococcus abyssii) Các gen thêm vào liên kết lỏng lẻo với CRISPR, thành viên họ protein liên kết bí ẩn với đoạn repeat (RAMP), xảy gen có bao gồm hệ thống CRISPR, khơng cần thiết nằm gần CRISPR Các miền chức cụ thể xác định protein Cas bao gồm miền endonuclease exonuclease, helicase, miền liên kết RNA DNA, miền liên quan đến điều hịa phiên mã.[4] Hình Một locus (vị trí) CRISPR cấu thành từ đoạn lặp (repeats) dài 21 đến 48 bp xen kẽ trình tự dài 26 đến 72 bp gọi đoạn đệm (spacers) Trong locus thì kích thước đoạn lặp đoạn đệm ổn định Mỗi locus CRISPR đặc trưng trình tự đoạn lặp điển hình locus Một locus CRISPR chứa đoạn lặp đoạn đệm, khơng có khung đọc mở (open reading frame) Thường locus CRISPR, hầu hết đoạn lặp có tính palindromic phần (nghĩa phần trình tự xi ngược giống nhau), dẫn đến khả hình thành nên cấu trúc thứ cấp ổn định cao CRISPR thường nằm nhiễm sắc thể, có trường hợp nằm plasmid Hệ thống locus CRISPR bao gồm leader region (là trình tự đánh dấu bắt đầu CRISPR array; CRISPR array trình tự bao gồm đoạn đệm lặp) dài từ 20 đến 534 bp CRISPR array phiên mã promoter nằm leader region Ngoài ra, ln tìm thấy vài gen kèm CRISPR (CRISPR-associated – Cas) vùng lân cận, tạo thành hệ thống CRISPR-Cas (bao gồm locus CRISPR gen Cas lân cận) Một hệ thống CRISPR-Cas thường gồm đến 20 gen cas khác Các gen cas mã hóa họ protein lớn đa dạng có domain điển hình nuclease, helicase, polymerase protein gắn polynucleotide Các gen cas nằm phía thượng nguồn hay hạ nguồn vùng lặp/đệm.[4] II.2 Nguồn gốc trình tự đệm Vùng đệm nguồn gốc từ trình tự tồn trước đó: Bộ nhiễm sắc thể vật liệu di truyền truyền thể thực khuẩn plasmid liên hợp Bất kỳ DNA nhiễm sắc thể cho dù bên hay bên ngồi vùng nhân khơng thể sát nhập vào đoạn đệm Các điểm tương đồng cao với trình tự đệm định tìm thấy yếu tố di truyền chủng có liên quan chặt chẽ với trình tự đệm Các trình tự đệm bắt nguồn từ yếu tố có Khoảng 65% vùng đệm tương đồng với trình tự phage plasmid tiếp hợp, 35% lại giống trình tự nhiễm sắc thể vi khuẩn Qua nhiều tìm hiểu trình tự đệm khơng liên quan trực tiếp đến DNA ngoại lai Điều tỷ lệ DNA nhiễm sắc thể đánh giá cao Thực tế có 88 trình tự đệm số khoảng 4500 Các đặc điểm nhận dạng quan trọng thăm dị hiểu lượng lớn yếu tố di truyền không xác định tự nhiên Trường hợp S pyogenes SF370 đặc biệt Tám số chín trình tự đệm cho thấy 90% đồng với trình tự bên prophage khác, cho thấy bảo tồn trình tự gen tương ứng phage Đồng thời, gợi lên liên quan chức gen nhắm mục tiêu trình tự đệm Các trình tự đệm thể tương đồng với gen phage plasmid bao gồm chức năng: chuyển plasmid; chép DNA; lắp ráp phage ; bảo vệ DNA chống lại hạn chế; chép phân vùng; tổng hợp phage; phân giải sao; vận chuyển tích hợp phage cắt bỏ [2] II.3 Hệ thống miễn dịch CRISPR Khi bị nhiễm DNA virus thông qua phage thông qua chuyển gene, phức hợp protein cas cắt đoạn DNA virus tạo thành đoạn spacer chế biến tạo nên đơn vị repeat-spacer, sau tiến hành chèn đơn vị repeat-spacer vào chuỗi CRISPR Như vậy, vi khuẩn có khả miễn dịch với xâm nhiễm virus vào lần sau Chuỗi CRISPR phiên mã tạo pre-crRNA, phức hợp protein cas tiến hành chế biến pre-crRNA tạo thành đơn vị cr-RNA Các đơn vị crRNA kết hợp với phức hợp protein cas bắt cặp bổ sung với DNA virus có mang proto-spacer PAM Khi khơng có trình tự PAM chuỗi CRISPR ngăn cản khả tự miễn dịch vi khuẩn 10 Hình Hoạt động hệ thống CRISPR / cas diễn theo bốn bước: Bước Các đệm tương ứng với đoạn DNA từ thể thực khuẩn nguồn khác kết hợp vào CRISPR Ít biết q trình Tuy nhiên, cho liên quan đến protein Cas1 Cas2 Ngoài ra, đệm thêm vào đầu cuối chuỗi CRISPR (HÌNH A) Bước Các locus CRISPR phải phiên mã thành pre-crRNA Một chuỗi khơng mã hóa đầu CRISPR, giàu adenine thymine, hoạt động chất xúc tiến cho mục đích Bước Pre-crRNA sau phải xử lý thành crRNA Mỗi đoạn crRNA bao gồm đoạn đệm đơn hai nửa lần lặp lại Bước Sau xử lý, crRNA sử dụng để vô hiệu hóa vật liệu di truyền ngoại lai.[9] II.4 Sự hình thành đơn vị CRISPR Cas1 loại protein có tính bảo tồn cao, tìm thấy tất loại CRISPR Cas1 tương tác với Cas2 để tạo thành phức hợp giúp gắn chèn đoạn spacer Phức hợp heterohexameric [(Cas12-Cas2)2] bao gồm vùng liên kết với proto-spacer vùng lại liên kết với chuỗi CRISPR.[5] Khi có spacer, phức hợp Cas1-Cas2 xúc tác phản ứng cắt-nối Phản ứng thứ đầu leader đoạn repeat chuỗi CRISPR, phản ứng thứ hai đầu spacer đoạn repeat Sản phẩm tạo có đầu 3’ dsDNA proto-spacer liên kết với ssDNA đoạn repeat Những chỗ trống ssDNA repeat tổng hợp nhờ DNA polymerase nối lại Kết spacer chèn vào chuỗi CRISPR đoạn repeat nhân đôi.[5] 11 Hình Sơ đồ minh hoạ trình chèn đoạn spacer vào chuỗi CRISPR [5] II.5 Mơ hình đơn giản hoá cho hoạt động CRISPR Chuỗi repeat-spacer phiên mã thành đoạn RNA dài, đoạn repeat tạo thành cấu trúc bậc Cas protein nhận diện trình tự cấu trúc đoạn repeat biến đổi RNA tạo thành nhiều đoạn sRNA (small RNA), đoạn sRNA bao gồm đoạn spacer hai nửa đoạn repeat hai đầu sRNA kết hợp với Cas protein, bắt cặp bổ sung với nucleic 12 acid phage phá huỷ chúng Q trình có tham gia nhiều Cas protein [4] Hình Mơ hình đơn giản hố cho hoạt động CRISPR [4] II.6 Hoạt động Endoribonuclease protein Cas6 Pyrococcus furiosus Hình A Sản phẩm phiên mã từ chuỗi CRISPR Cas6 phân cắt vùng repeat để tạo thành đoạn crRNA, đoạn crRNA tiếp tục cắt bỏ đuôi 3’ B Mô hình crRNA hồn chỉnh bao gồm 5’ tag có nguồn gốc từ đoạn repeat tế bào chủ (8 nucleotide) tồn trình tự đường (Guide sequence, 37 nucleotide) có nguồn gốc từ virus xâm nhiễm C Cas6 endoribonuclease quan trọng cho hình thành crRNA Cas6 tương tác với vùng 5’ CRISPR repeat RNA (khung màu đỏ), cắt ngồi bìa sử dụng vị trí hoạt hố bao gồm amino acid (His, Lys Tyr) Vùng liên kết với Cas6 crRNA tương tác với khe tích điện dương protein Cas6 [6] Để Cas6 nhận diện crRNA cắt vị trí đặc hiệu, Cas6 nhận diện theo chiều ngược trình tự repeat vị trí nucleotide 2-9 cắt theo chiều xi vị trí nu 22 23 Trong thí nghiệm in vivo, Cas6 liên kết ổn định với sản phẩm cắt khơng liên kết với crRNA hồn chỉnh crRNA hồn chỉnh cắt bỏ trình tự đầu 3’, dẫn đến khả nhận diện bám Cas6.[6] 13 Hình Hoạt động Endoribonuclease protein Cas6 Pyrococcus furiosus [6] II.7 CRISPR cung cấp khả miễn dịch sinh vật nhân sơ Streptococcus thermophilus vi khuẩn Gram dương có tỉ lệ G+C thấp Phân tích gen chủng S thermophilus có liên quan gần cho thấy đa hình di truyền xảy chủ yếu locus siêu biến eps rps operon, hai CRISPR locus CRISPR locus điển hình bao gồm vài đoạn repeat thẳng không liền mạch bị phân chia trình tự đa dạng gọi spacer vùng repeat/spacer thường nằm cạnh gen cas Các phân tích in silico trình tự spacer tiết lộ trình tự đoạn spacer tương đồng với yếu tố ngoại lai bao gồm phage plasmid Dựa nghiên cứu sâu rộng cho thấy vai trò CRISPR gen cas bao gồm khả miễn dịch chống lại yếu tố di truyền bên ngồi thơng qua chế dựa RNA interference Khi phân tích trình tự CRISPR chủng S thermophilus đa dạng bao gồm chủng hoang dã (WT) chủng kháng phage Sự khác số lượng phân loại spacer quan sát chủ yếu locus CRISPR1 Rõ ràng, tính nhạy với phage có mối tương quan với CRISPR1 spacer Đặc biệt, spacer có thành phần gần giống bố mẹ có nguồn gốc kháng phage, ngoại trừ spacer xuất sau Phát gợi lên mối 14 quan hệ tiềm có mặt spacer thêm vào với khác tính nhạy cảm phage chủng Chủng WT DGCC7710: mơ hình mẫu nhạy cảm với phage hai phage gây độc với vi khuẩn phân lập từ mẫu yogurt công nghiệp phage 858 phage 297 đột biến kháng phage tạo độc lập cách thử thách chủng WT với phage 858 phage 2972 lúc với hai phage, sau phân tích CRISPR locus thu Sự khác quan sát CRISPR1 locus, với spacer 1-4 chèn vào bên cạnh 32 soacer có chủng WT Giải trình tự đoạn spacer chèn vào locus CRISPR1 thể đột biến kháng phage cho thấy giống với trình tự tìm thấy gen phage sử dụng để thử nghiệm Điều thú vị trình tự tương đồng quan sát gen thực khuẩn, hầu hết mo-đun chức năng, chuỗi mã hố khơng mã hố, khơng có trình tự, gen hay nhóm chức nhắm mục tiêu cụ thể Kết cho thấy để trở nên đề kháng với phage, locus CRISPR1 biến đổi cách chèn spacer mới, có nguồn gốc từ DNA phage Chúng ta quan sát thấy có vài chủng kháng hai loại phage, chủng lại kháng với phage sử dụng để thử nghiệm Khả kháng phage có mối tương quan với thành phần spacer, chủng có spacer giống 100% trình tự bảo tồn hai phage kháng hai phage (spacer S3, S6, S7) Mặt khác, có đa hình nucleotide spacer trình tự phage (từ 1- 15 nucleotide đa hình đến 29 30 nucleotide), spacer khơng cịn tạo khả kháng phage, spacer S1, S2, S4, S5, S8 Thêm vào đó, vài spacer chèn (S9-S14) khả kháng phage mức độ cao Phát CRISPR1 locus đối tượng thúc đẩy tiến hố nhanh chóng gây nên phơi nhiễm phage Tổng hợp lại, kết cho thấy locus CRISPR thực bị thay đổi suốt trình tạo nên đột biến kháng phage có mối liên hệ tính nhạy cảm với phage thành phần spacer Phát diện đoạn spacer giống với trình tự phage cung cấp khả kháng lại phage có mang trình tự đó.[7] 15 Hình Sơ đồ minh hoạ cho khác thành phần đoạn CRISPR tác động lên tính nhạy cảm với phage thể đột biến.[7] II.8 CRISPR- Cas9 – công cụ chỉnh sửa gene phổ biến Chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9. Nguyên tắc chỉnh sửa gen phân cắt DNA sợi kép vị trí định gen. Loại II loại đơn giản làm nuclease nhắm mục tiêu số hệ thống CRISPR-Cas. CRISPR RNA (crRNA), có trình tự tương đồng với vị trí đích và CRISPR RNA chuyển hóa kích hoạt (tracrRNA) đủ để đưa nuclease Cas9 đến vị trí đích. Sự liên kết nhân tạo crRNA tracrRNA thành chuỗi RNA (RNA dẫn đường đơn [sgRNA]) không ảnh hưởng đến chức năng. Một phức hợp Cas9-sgRNA phân cắt gen mục tiêu, dễ làm phá vỡ chức gen đột biến xóa chèn. Phương pháp đơn giản nhanh chóng lan rộng kỹ thuật chỉnh sửa gen thực tế.[8] Hình Chỉnh sửa gene hệ thống CRISPR-Cas9 [8] Cấu trúc đơn giản phức hợp effector làm cho hệ thống CRISPR-Cas lớp trở thành lựa chọn hấp dẫn để phát triển hệ công nghệ chỉnh sửa gene Một số effector laoij2 khác biệt báo cáo, bao gồm Cas9 loại II, Cas12a (trước Cpf1), Cas 12b (C2c1) loại V, Cas13a (C2c2) Cas13b (C2c3) loại VI Protein effector đa miền phổ biến nghiên cứu tốt Cas9, endonuclease phụ thuộc crRNA, bao gồm hai miền nuclease RuvC HNH, có vai trò phân cắt sợi DNA bị dịch chuyển (nontarget) DNA mục tiêu Locus CRISP- cas loại II mã hoá tracrRNA (trans-activating crRNA) phát triển từ CRISPR tương ứng Phân tử 16 tracrRNA cần thiết cho trình xử lý tiền crRNA nhận dạng mục tiêu hệ thống CRISPR loại II Cơ chế phân tử phân cắt DNA đích phức hợp Cas9-crRNA làm sáng tỏ cấp độ nguyên tử phân tích cấu trúc tinh thể phức hợp DNACas9-crRNA [8] Hình 10 Cơ chế phân cắt DNA mục tiêu crRNA-tracrRNA-Cas9. Phức hợp Cas9crRNA-tracrRNA liên kết với DNA ngoại lai có chứa PAM, nơi Cas9 liên kết bắt đầu tháo sợi kép DNA ngoại lai để tạo hình thành phức hợp crRNA DNA ngoại lai. Cas9 bao gồm hai vùng, gọi thùy REC (nhận biết) thùy NUC (nuclease). Thùy REC chịu trách nhiệm nhận dạng axit nucleic. Thùy NUC chứa miền nuclease HNH RuvC vùng đầu cuối C chứa miền tương tác PAM (PI). Miền HNH miền RuvC phân cắt sợi DNA, tạo thành đoạn kép tương ứng với crRNA sợi DNA khác, đứt gãy sợi kép xảy DNA đích.[8] 17 Tài liệu tham khảo [1] Lampson, B C., Inouye, M., & Inouye, S (2005). Retrons, msDNA, and the bacterial genome Cytogenetic and Genome Research, 110(1-4), 491–499. doi:10.1159/000084982  [2] Mojica, F J M., D�ez-Villase�or, C., Garc�a-Mart�nez, J., & Soria, E (2005). Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive from Foreign Genetic Elements Journal of Molecular Evolution, 60(2), 174– 182. doi:10.1007/s00239-004-0046-3  [3] Golubov, A (2016). CRISPR Genome Stability, 87–98. doi:10.1016/b978-0-12803309-8.00006-9 [4] Sorek, R., Kunin, V., & Hugenholtz, P (2008). CRISPR — a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea Nature Reviews Microbiology, 6(3), 181–186. doi:10.1038/nrmicro1793  [5] McGinn, J., & Marraffini, L A (2018). Molecular mechanisms of CRISPR–Cas spacer acquisition Nature Reviews Microbiology. doi:10.1038/s41579-018-0071-7  [6] Terns, R M., & Terns, M P (2013) The RNA- and DNA-targeting CRISPR–Cas immune systems ofPyrococcus furiosus Biochemical Society Transactions, 41(6), 1416– 1421 doi:10.1042/bst20130056 [7] Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., … Horvath, P (2007). CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes Science, 315(5819), 1709–1712. doi:10.1126/science.1138140  [8] Ishino, Y., Krupovic, M., & Forterre, P (2018). History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology Journal of Bacteriology, 200(7). doi:10.1128/jb.00580-17  [9] Barrangou, R., Horvath, P (2009). The CRISPR system protects microbes against phages, plasmids Micrope,  4(5):224-230 DOI:10.1128/microbe.4.224.1 [10] Millman et al., 2020 Bacterial Retrons Function In Anti-Phage Defense Cell 183, 1– 11 DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.065 18 Bảng đánh giá thành viên nhóm Họ tên Phan Thị Ngọc Hà Ý Khánh Nguyên Trương Thị Kim Ngân Phân công Chịu trách nhiệm nội dung slides 6872 Chịu trách nhiệm nội dung slides 7376 Chịu trách nhiệm nội dung slides 7782 19 Đánh giá 8/10 8/10 9/10 ... đồng cao với trình tự đệm định tìm thấy yếu tố di truyền chủng có liên quan chặt chẽ với trình tự đệm Các trình tự đệm bắt nguồn từ yếu tố có Khoảng 65% vùng đệm tương đồng với trình tự phage plasmid... giống với trình tự tìm thấy gen phage sử dụng để thử nghiệm Điều thú vị trình tự tương đồng quan sát gen thực khuẩn, hầu hết mo-đun chức năng, chuỗi mã hoá khơng mã hố, khơng có trình tự, gen hay... nhỏ có khả gây ảnh hưởng lớn đến tế bào chủ Điều bao gồm vi? ??c tạo lặp lại trình tự msDNA gen làm tăng tần số xuất đột biến Bởi kiện liên quan đến retron RT, điều đại di? ??n cho nguồn phiên mã ngược