Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate

Tài liệu tham khảo chuyên ngành công nghệ sinh học Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate

Phần 1

LỜI NÓI ĐẦU

Enzyme là một chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thức phẩm, trong y học, trong kỹ nghệ phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường

Ngày nay, những nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong sản xuất công nghiệp phát triển rất mạnh Các hướng nghiên cứu nhằm mục đích tăng khả năng sử dụng enzyme, kéo dài thời gian, số lần sử dụng enzyme giảm giá thành sử dụng enzyme Một trong những bước tiến quan trọng nhất hiện nay là kỹ thuật cố định enzyme trên giá thể tạo ra các dạng enzyme cố định (enzyme không hòa tan) Enzyme cố định ở các nước phát triển đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều qui trình công nghệ như: chế biến thực phẩm, y sinh học và nghiên cứu khoa học Tuy nhiên hiện nay việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme cố định ở Việt Nam chưa được phổ biến lắm và vẫn còn là hướng phát triển mới mẻ

Để góp phần vào những nghiên cứu về enzyme cố định đồng thời được sự chấp thuận của bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh,

dưới sự hướng dẫn của Th.S Huỳnh Ngọc Oanh, tôi thực hiện đề tài “Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate” tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học

thuộc trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh

Phần 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME [2 ]

2.1.1 Khái niệm về enzyme

Trong các phản ứng hóa học nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần Chất cho thêm vào này gọi là chất xúc tác

Chất xúc tác có hai đặc điểm quan trọng  Làm tăng phản ứng hóa học

 Bản thân chất xúc tác không có sự thay đổi nào sau phản ứng

Chất xúc tác hóa học chỉ làm thay đổi tốc độ phản ứng, chứ không tham gia làm thay đổi chiều hướng phản ứng, trạng thái phản ứng hay năng lượng sử dụng trong phản ứng Trong các phản ứng sinh học xảy ra trong cơ thể sinh vật cũng có

các chất làm tăng phản ứng Chất đó dược gọi là enzyme

Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng hóa học trong cơ thể Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi các chất xúc tác hóa học thường là chất vô cơ Sau này các nhà khoa học xác định bản chất của enzyme là protein

Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể

Điểm rất khác biệt của enzyme là chúng hoạt động trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa giống như nhiệt độ ôn hòa trong cơ thể sinh vật Trong khi đó, các chất hóa học cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng Những ưu điểm cơ bản của enzyme có thể tóm tắt như sau :

1 Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất

2 Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao

3 Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền Khi đó sản phẩm của phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo

4 Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít 5 Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật

6 Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng Ngày nay, các nhà khoa học đã tìm ra hơn 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này là rất nhỏ so với số lượng thật có trong mỗi tế bào

Dị hóa ngoài tế bào

Vật chất có kích thước nhỏ

Tế bào

Vật chất dị hóa ra khỏi tế bào Vật chất tổng hợp

ra khỏi tế bào

(sản phẩm bậc 1)

Sản phẩm bậc 2

Hình 2.1 : Hệ thống tổng hợp enzyme trong tế bào sinh vật

Enzym ngoại bào

Vật chất có kích thước lớn

nội bào trong tế

Quá trình bào

tổng hợp

2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme a Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme

Cơ chế tác động của enzyme vào cơ chất qua ba giai đoạn

Giai đoạn 1 : Enzyme tương tác với cơ chất tạo thành phức enzyme cơ chất E S

Giai đoạn 2 : Phức enzyme cơ chất sẽ được tách ra

Giai đoạn 3 : Enzyme sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm Như vậy ở giai đoạn đầu, nếu cơ chất có nồng độ thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất

Hình 2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng của enzyme

Vận tốc phản ứng được tính như sau :

max

Phương trình trên gọi là phương trình Michealis Menten

Trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng Nhưng khi tốc đố phản ứng đạt giá trị cực đại, cho dù có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo

Nồng độ cơ chất Tốc độ

phản ứng

Km

b Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme

Trong các phản ứng hóa học, nhiệt độ càng tăng, tốc độ phản ứng xúc tác càng tăng Trong các phản ứng sinh học, nhiệt độ tăng khả năng xúc tác của enzyme sẽ tăng Nhưng khả năng tăng của tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất định Quá giới hạn nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh

Hình 2.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng của enzyme

Hiện tượng đặc biệt này ở enzyme có liên quan đến bản chất hóa học của enzyme Các enzyme là những protein thường không bền nhiệt Trường hợp ta tăng nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng enzyme sẽ làm tăng khả năng tạo cấu trúc không gian của enzyme cho phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất Khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất nữa, khi đó hoạt tính enzyme sẽ mất dần và đi đến chỗ triệt tiêu

c Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme

Trong những nghiên cứu thí nghiệm về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme, các nhà khoa học cho thấy hiện tượng : nếu tăng hoặc giảm giá trị pH tới một điểm xác định nào đó, vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng dần và đạt tới điểm cực đại giá trị pH, mà ở đó vận tốc phản ứng enzyme đạt giá trị cực đại gọi là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme Vượt quá giá trị pH này hoạt động enzyme sẽ giảm

Nhiệt độ Tốc độ

phản ứng

Hình 2.4: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme

Mỗi loại enzyme sẽ có khoảng pH tối ưu và điểm pH tối ưu

pH có ảnh hưởng rất lớn đến trạng thái ion hóa của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme, trạng thái ion hóa của cơ chất và phức chất ES

d Ảnh hưởng của các chất kìm hãm các hoạt tính enzyme

Hoạt tính của enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi những chất kìm hãm Những chất kìm hãm là những chất hoa học có khả năng làm giảm hoạt tính hoặc làm ngưng hoạt tính của enzyme Các chất kìm hãm thường là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ và cả protein

Các chất chia ra làm 2 loại : Chất kìm hãm cạnh tranh

Chất kìm hãm không cạnh tranh

Chất kìm hãm cạnh tranh : Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc không gian tương tự cấu trúc không gian của cơ chất Do đó, chúng có khả năng kết hợp với enzym, kết quả là enzym không thể kết hợp được với cơ chất để tạo thành phức chất ES

pH Vận tốc

phản ứng

pH op

Hình 2.5 : Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh đến hoạt tính enzyme

Chất kìm hãm không cạnh tranh :

Các chất kìm hãm không cạnh tranh tham gia kết hợp với enzym không phải ở trung tâm hoạt động của enzym mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzym Người ta còn gọi vị trí này là trung tâm kìm hãm của enzym

Khi chất kìm hãm kết hợp với enzym ở ngoài trung tâm hoạt động của enzym sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzym Nhờ vậy, chúng sẽ làm giảm tốc độ phản ứng của enzym Trong rất nhiều trường hợp, sản phẩm cuối của chuỗi phản ứng hay của một phản ứng thường là chất kìm hãm không cạnh tranh

Hình 2.6 : Ảnh hưởng của chất kìm hãm không cạnh tranh đến hoạt tính enzyme

e Ảnh hưởng của chất hoạt hóa đến hoạt tính của enzym

Các chất hoạt hóa (activator) là những chất làm tăng khả năng xúc tác của enzym Các chất hoạt hóa có bản chất hóa học khác nhau Các amin, các chất hữu cơ có cấu trúc hóa học khác nhau

Khả năng làm tăng hoạt tính của enzym của những chất hoạt hóa cũng có một giới hạn nhất định, vượt quá giới hạn này rất có thể lại làm giảm hoạt tính của enzym

2.2 NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYM CỐ ĐỊNH

2.2.1 Khái niệm, đặc điểm của enzym cố định a Khái niệm enzym cố định

Enzym cố định (immobilised enzym) hay enzym không hòa tan (insolube enzym) được hiểu theo cả nghĩa hẹp và nghĩa rộng

Theo nghĩa hẹp : được hiểu theo Michael Trevan: thuật ngữ enzyme cố

định là những enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với pha dung dịch tự do Pha enzyme thường không tan trong nước và được gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

Pha enzyme

// Pha dung dịch tự do

Hình 2.7 : Mô hình hệ thống hai pha của enzym cố định

Theo nghĩa rộng : Theo Kkaus Mosbach : Các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại Như vậy theo nghĩa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm cả enzyme đã được cố định và một

chất mang, bao gồm cả enzyme có trong tế bào sống được cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần

Enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau Nhờ quá trình gắn này enzyme chuyển từ trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan

b Đặc điểm của enzyme cố định

Nhờ những tính chất ưu việt do đó ngày nay enzyme cố định đang ngày càng sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghệ : Những ưu điểm nổi bật của enzyme cố định

Enzyme là những chế phẩm sinh học đắt tiền, nếu sử dụng ở dạng hòa tan thì chỉ sử dụng được một lần và khó thu hồi trở lại Ngược lại khi enzyme được cố định trên giá thể polymer nên có thể sử dụng liên tục trong nhiều ngày, thậm chí hàng tháng mà không mất hoặc chỉ giảm hoạt tính, vì vậy rất kinh tế

Do được cố định ở một pha riêng, do đó dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi enzyme, vì vậy sản phẩm dễ tinh sạch hơn do không trộn lẫn với enzyme Điều này đặc biệt có ý nghĩa khi ứng dụng enzyme cố định trong dược học, trong công nghệ sản xuất hóa chất và trong phân tích

Có thể dừng hóa trình chuyển hóa ở bất kỳ giai đoạn nào cần thiết khi dễ dàng tách enzyme cố định ra khỏi cơ chất trong trường hợp yêu cầu sản phẩm chỉ là các sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hóa

– Khi được cố định trên giá thể enzyme có khả năng bền vững hơn, hoạt tính ổn định hơn khi có những thay đổi của môi trường như nhiệt độ, pH,… so với enzyme tự do Nhờ được cố định trên giá thể nên enzyme ít bị biến tính hơn khi môi trường thay đổi

Sử dụng chế phẩm enzyme cố định, đặc biệt thích hợp với các qui trình công nghệ liên tục, tự động hóa ngày nay Thường thì enzyme cố định được nhồi

vào các cột, tháp, fermentor, với dòng cơ chất liên tục được chảy vào và đầu ra là sản phẩm

Tuy nhiên enzyme cố định cũng có những nhược điểm nhất định là vì được cố định nên đã hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất Vì vậy hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme cố định thường thấp hơn so với enzyme tự do, đặc biệt là trong trường hợp cơ chất là các chất có trọng lượng phân tử lớn như : protein, tinh bột, chitosan Trong trường hợp enzyme được cố định bằng phương pháp nhốt (entrapment method) trong khuôn gel thì chỉ một phần enzyme nằm ở lớp vỏ ngoài của gel là hoạt động Đặc biệt khi enzyme được cố định bằng phương pháp cộng hóa trị thì một lượng đáng kể enzyme bị mất hoạt tính do chất hoạt hóa và có thể do liên kết không đặc hiệu xảy ra ở trung tâm hoạt động của enzyme

2.2.2.Chất mang dùng để cố định enzyme

 Theo Michael Trevan, một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau đây :

+ Chất mang lý tưởng trong sử dụng cố định enzyme điều trước hết là cần phải rẻ Điều này liên quan đến hiệu quả kinh tế của qui trình công nghệ

+ Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định

+ Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng Chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme

+ Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật

+ Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định enzyme vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme cố định và số lần tái sử dụng

+ Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể sử dụng ở dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng …

 Phân loại chất mang :

Tất cả chất mang dùng trong cố định enzyme được chia làm 2 nhóm : Chất mang polymer hữu cơ

Chất mang vô cơ

a Chất mang là polymer hữu cơ

Trong nhóm chất mang là polymer hữu cơ được chia làm 2 nhóm là polymer tổng hợp và polymer tự nhiên

 Chất mang là polymer tự nhiên (natural polymer)

 Chất mang là polysaccharide (gluxit) :

Là nhóm chất mang đang thịnh hành và được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, đó là cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng

Agarose là vật liệu ổn định, đồng nhất dễ dàng tạo hạt Tuy nhiên do vấn đề về giá cả nên agarose chỉ thường được sử dụng trong nghiên cứu và mục đích y học (theo signa : 800 2000 USD/kg)

Cellulose và các dẫn suất của chúng như CM Cellulose, DEAE Cellulose có tính chất cơ lý khá tốt, giá rẻ nhưng lại không đồng nhất và ổn định nên chỉ sử dụng ở dạng sợi và dạng vi hạt

Alginate và carrageenam là hai loại vật liệu khá mới mẻ Cả hai loại vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl2 dùng để nhốt tế bào và enzyme Tuy nhiên, hai loại vật liệu này có một nhược điểm căn bản là gel không ổn định trong môi trường có phosphate

Tinh bột là vật liệu phong phú và rẻ tiền Từ lâu tinh bột, tinh bột khâu mạch, diathanolamin tinh bột đã được dùng làm chất mang cố định enzyme như lipase, glucoisomerase, tripsin, amilase Tuy nhiên tinh bột có nhược điểm là độ trương còn hạn chế và thiếu các nhóm chức năng (functional groups) Vì vậy khả

năng cố định và hoạt tính enzyme cố định còn thấp : để khắc phục nhược điểm này tinh bột thường được ghép copolymer với các vinyl monomer ưa nước, acrylamide, acrylic acid vừa cải thiện tính chất cơ lý, độ trương, vừa tạo các nhóm chức năng trên bề mặt như [ NH2], [ COOH] làm tăng diện tích tiếp xúc và khả năng cố định enzyme

Chitin và chitosan là vật liệu polymer có nhiều triển vọng trong cố định tế bào và enzyme Chitin là một polymer rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng thứ hai sau cellulose, chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là polymer của 2 acetomido deoxy D glucose Chitin tham gia vào thành phần cấu trúc của vỏ tôm cua, côn trùng, thành tế bào vi sinh vật Chitosan là dẫn xuất của chitin khi xử lý bằng kiềm đặc Chitin, chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp thụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn định, thường được dùng cố định enzyme qua cầu nối glutaraldehyde

Tuy nhiên cả chitin và chitosan đều có một nhược điểm là tính chất kỵ nước, độ trương kém, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay đang có xu hướng ghép copolymer với monomer ưa nước như acrylamide, acrylic acid, hydroxy ethylmethacrylate

Hiện nay, cũng có xu hướng chung là các vật liệu tự nhiên được ghép copolymer với các polymer tổng hợp để cải thiện tính chất cơ lý

 Chất mang là Protein :

Chất mang là protein thường dùng là getalin, keratin, albumin Vật liệu thuộc nhóm này thường dễ tạo màng, tạo hạt, có nhóm chức năng là nhóm NH2

và vì vậy thường dùng sử dụng nhốt enzyme trong khuôn gel với tác nhân khâu mạch là glutaraldehyde Nhóm chất mang này là protein có nhược điểm là thường kém bền, dễ nhiễm khuẩn

 Chất mang là các polymer tổng hợp :

Hiện nay có rất nhiều polymer tổng hợp được sử dụng làm chất mang cố định enzyme như polyacrylamide, polyester, polyvinilalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxylethylacrylate, polystyren, polyethylen ghép với vinyl monomer, …Ưu điểm chung của các polymer tổng hợp là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể điều chỉnh được kích thước siêu lỗ, …

– Polyhydroxyethylmethacrylate : khả năng tương hợp sinh học kém và một nhược điểm quan trọng nữa là do quá bền vững, không phân hủy trong tự nhiên Vì vậy gây ô nhiễm môi trường Đây là vấn đề quan trọng đòi hỏi con người cần quan tâm giải quyết

– Polyacrylamide là một polymer rất đồng nhất, độ trương tốt, kích thước lỗ gel có thể điều chỉnh được và diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Polyacrylamide và polyacrylate thường được nạp vào cột, và có rất nhiều dạng khác nhau như polymer có nhóm amin hoặc aldehyde Phương pháp cố định chủ yếu là nhốt enzyme tế bào trong khuôn gel khi được polymer bằng hóa chất như ammoniumpersulphate, bức xạ gamma, tia rơnghen, thường thì để tăng khả năng khâu mạnh của gel poly acrylamide, cần phải bổ sung thêm N, N methylenbisacrylamide làm chất khâu mạch (crosslinking agent) Ngoài ra còn có thể cố định enzyme trên các vật liệu này bằng phương pháp hấp thụ, liên kết cộng hóa trị và microcapsule

b Chất mang vô cơ

Ngoài các polymer được sử dụng làm chất mang, còn có một số chất mang vô cơ đã được sử dụng thương mại như sợi bông thủy tinh (contra pore glass), oxyde silica, oxyde nhôm, oxyde magie Đây là những dạng oxyde có cấu trúc lỗ và có khả năng hấp thụ tốt Một số vấn đề cần chú ý khi dùng các vật liệu có nguồn gốc từ silic là khá đắt tiền, nên chỉ sử dụng trong sắc ký lọc gel và cố định những enzyme đặc biệt Nhược điểm của các vật liệu này là tan trong kiềm, có pH > 7.5

Để hạn chế điều này pore glass, pore silics được phủ lớp ziconia để tạo một lớp ổn định với kiềm, hoặc để tránh vấn đề này có thể sử dụng ceramic xốp để cố định enzyme

Gần đây một số vật liệu vô cơ được giới thiệu thương mại hóa là các sản phẩm diatomic, có tên thương mại là celite Đây là một vật liệu không đồng nhất, chứa nhiều ion kim loại, là loại vật liệu rẻ tiền, nhưng có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp, đặc biệt là trong cố định enzyme và trong công nghiệp

Vật liệu từ tính (magnetic materials) có rất nhiều dạng đã được sử dụng trong cố định enzyme Burns đã so sánh dạng hạt của vật liệu từ tính với các vật liệu khác và với sự cải tiến của tổ hợp alginite/ vi hạt từ tính Alginite thường sử dụng ở dạng cộng hóa trị vì ligand với enzyme hơn là ở dạng nhốt Vi hạt (microphere) của vật liệu alginite/ vi hạt từ tính có tính chất cơ lý tốt, diện tích bề mặt và độ phân tán tốt, các khả năng cố định bằng phương pháp cộng hóa trị cao Những ứng dụng của vật liệu này vô cùng phong phú

2.2.3.Các phương pháp cố định enzyme

Hiện nay có 4 phương pháp chính điều chế enzyme cố định dựa trên cơ sở lý hóa học như sau :

– Phương pháp hấp thụ vật lý enzyme lên các vật liệu cố định không hòa tan có mang hoặc không mang điện tích

– Phương pháp nhốt enzyme ở bên trong polymer tạo thành xung quanh enzyme một hệ thống lưới có lỗ nhỏ để không cho phân tử enzyme đi khỏi màng, nhưng các lỗ đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra đi qua được dễ dàng

– Phương pháp hóa học : liên kết cộng hóa trị và liên lết ion – Phương pháp khâu mạch

a Phương pháp hấp thụ vật lý (Physical Absortion)

Phương pháp này có ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là trong giai đoạn đầu của việc nghiên cứu enzyme cố định Quá trình thực hiện hấp thụ khá đơn giản : chất

hấp thụ và enzyme được trộn lẫn với nhau, ủ một thời gian rồi lọc, rửa phần enzyme không hấp thụ Enzyme gắn được trên giá thể nhờ tương tác của các liên kết yếu như liên kết : ion, kỵ nước, hydrogen và lực Vander Waals Khả năng hấp thụ của enzyme phụ thuộc vào các điều kiện môi trường như : nhiệt độ, nồng độ enzyme, diện tích bề mặt tiếp xúc của vật liệu cố định

Vật liệu cố định hữu cơ chủ yếu được sử dụng là các dẫn xuất của polysacchride tự nhiên như : cellulose và dextran Theo Mitz và Schlueter thì các enzyme có tính acid như pepsin dễ dàng kết hợp với DEAE Cellulose, còn các enzyme có tính kiềm như trypsin và chymotrypsin thì kết hợp dễ dàng với CM cellulose, phosphate cellulosehoặc citrate cellulose Các dẫn xuất cellulose này có thể gắn được 2 50% enzyme

Vật liệu cố định vô cơ như: thủy tinh xốp, silicagel, cytochrom cũng được sử dụng, các vật liệu này có ưu điểm là chúng có khả năng thay đổi độ xốp lớn và có khả năng hấp thụ cao đối với protein

Phương pháp này có nhược điểm là quá trình giải hấp thụ enzyme (enzyme cố định trở thành dễ hòa tan) dễ dàng xảy ra khi thay đổi pH, nhiệt độ và thành phần ion

 Yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cố định của vật liệu

Nồng độ enzyme : nồng độ enzyme càng cao thì sự hấp thụ càng nhiều,

theo công thức của Freundlick

Với : K1, K2 hằng số

m số lượng enzyme có khả năng hấp thụ lên bề mặt vật liệu C : Nồng độ enzyme

Công thức của Langmuiz :

221

Thời gian tiếp xúc : cho enzyme tiếp xúc với bề mặt của vật liệu cố

định, tốc độ hấp thụ phụ thuộc vào đặc tính lý hóa của chất hấp thụ và enzyme

Kích thước của vật liệu cố định : tốc độ hấp thụ càng tăng khi kích

thước càng giảm

Nhiệt độ : khi nhiệt độ tăng, tốc độ hấp thụ tăng, quá trình hấp thụ xảy

ra rất nhanh chỉ sau vài phút thì enzyme sẽ hấp thụ lên trên bề mặt

pH : quá cao hoặc quá thấp đều làm giảm khả năng hấp thụ, thông

thường sự hấp thụ tối đa ở pH điểm đẳng điện

Thành phần môi trường : các chất làm giảm tính hòa tan của enzyme

trong pha nước, sẽ làm tăng khả năng hấp thụ Như vậy muốn hấp thụ càng nhiều, càng làm giảm tính hòa tan của enzyme

b Phương pháp “nhốt” enzyme (Entrapment Method)

Đây là phương pháp đơn giản, enzyme ít bị biến đổi bởi quá trình cố định Phương pháp này có thể cố định nhiều enzyme cùng một lúc Giới hạn của phương pháp này là hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, do đó hoạt tính enzyme thường thấp, nhất là trong trường hợp cơ chất có trọng lượng phân tử lớn

Enzyme được bao bọc trong một màng không thẩm thấu đối với enzyme và các chất có trọng lượng phân tử cao, nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm thẩm thấu qua một cách dễ dàng Phương pháp này cho phép giữ enzyme trong dung dịch gần giống với tự nhiên và sử dụng enzyme nhiều lần vì có thể tách và thu nó dễ dàng khỏi sản phẩm của quá trình phản ứng bằng cách lọc

Các phương pháp nhốt enzyme trong màng bán thấm :

Hình 2.8: Nhốt Enzym trong sợi có lỗ nhỏ

Hình 2.9: Enzym được nhốt trong sợi mãûnh

Hình 2.10: Nhốt enzym trong gel Hình 2.11: Nhốt enzym trong micro – capsule

 Nhốt trong cấu trúc mạng Gel

Enzyme được nhốt trong cấu trúc mạng gel của các polymer như poly sacchride, protein, polymer tổng hợp như polyacrylamide, polyhydroethylacrylate … Các polysaccharide thường dùng là gel alginate và carrageenan là các poly anion dễ dàng tạo hạt trong dung dịch muối Ca, K và không bền trong môi trường có phosphate Khắc phục nhược điểm này bằng cách cho gel khâu mạch trong dung dịch glutaraldehyde Gel chitosan ổn định hơn, chitosan được tạo hạt trong dung dịch khâu mạch là polyphosphate, K4Fe(CN)6 thường được sử dụng nhốt tế bào và enzyme

Protein thường dùng là gelatin, enzym được trộn với gel gelatin sau đó được khâu mạch trong dung dịch glutaraldehyde hoặc aldehyte collagen là vật liệu protein có thể dùng để nhốt enzyme trong gel của nó, nhờ khả năng khâu mạch của gel trong dung dịch khâu mạch glutaraldehyde khi được khâu mạch hạt gel không tan và ổn định cao

E

 Giới thiệu về gel alginate thương phẩm

Là loại vật liệu thích hợp nhốt enzyme Phương pháp tạo hạt rất đơn giản Hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dịch CaCl2 để tạo hạt gel bao bọc lấy enzyme

Sản phẩm khi hòa tan hoàn toàn trong nước sẽ tạo thành dạng gel liên kết thành một chuỗi các polyanion với sự sắp xếp của 2 thành phần: mannuronate và glucuronate có thể là một chuỗi (M M M) (G G G) hoặc có thể đó là (M

G M G) Tỉ lệ cao của glucuronate làm gia tăng sự bền vững của gel Cấu trúc liên kết do Phillips, Wedlock and Williams đưa ra :

Khi cho hỗn hợp enzyme và sodium alginate nhỏ từng giọt xuống dung dịch CaCl2 sẽ tạo thành những hạt kết tủa có cấu trúc bền vững (0.5 4mm) chứa enzyme bên trong Enzyme được bao bọc trong một màng không thẩm thấu đối với enzyme và các chất có trọng lượng phân tử cao, nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm thẩm thấu qua một cách dễ dàng Điều này cho phép giữ enzyme trong dung dịch gần giống với tự nhiên và sử dụng enzyme nhiều lần

Enzyme + alginate CaCl2

Hạt Calcium alginate với enzyme cố định

Phương trình phản ứng :

 Đặc điểm của gel alginate

Gel alginate có khả năng nhốt một lượng lớn tế bào và enzyme, hiệu suất nhốt enzyme cao, thao tác và kỹ thuật tiến hành đơn giản

Hạt gel có kích thước có thay đổi từ 0.5 4mm Hạt có cấu trúc bền vững Để ổn định hạt gel có thể cho hạt gel khâu mạch trong dung dịch glutaraldehyde hoặc các chất khâu mạch khác Tuy nhiên gel này lại không bền trong môi trường có phosphate

 Phương pháp nhốt gel trong hệ sợi

Năm 1972, Dinelli đã tiến hành một thí nghiệm khá độc đáo là nhốt enzyme trong hệ sợi và những nghiên cứu này được kết thúc năm 1978 Theo kết quả nghiên cứu của Dinelli, enzyme khi được nhốt vào hệ sợi phát huy khả năng xúc tác rất tốt

Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi có khả năng xúc tác phản ứng tốt hơn phương pháp nhốt enzyme trong gel Các sợi sử dụng để nhốt enzyme thường là sợi nhân tạo Các loại sợi này có độ bền với acid, kiềm, các loại ion và các loại dung môi hòa tan Tính chất trên phụ thuộc rất nhiều vào bản chất hóa học của các polymer tạo ra loại sợi này

 Phương pháp tạo vi nang (microcapsule)

Khác với phương pháp nhốt trong gel, ở phương pháp này enzyme được nhốt trong một màng bán thấm, nhưng cơ chất và sản phẩm dễ dàng đi qua Vì hoạt động trong môi trường dung dịch, nên khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme lớn hơn trong trường hợp nhốt trong khuôn gel

Hình 2.12: Qui trình nhốt enzyme trong microcapsule

 Phương pháp siêu lọc (ultrafilitration)

Nguyên tắc của phương pháp này cũng tương tự phương pháp micro capsule Enzyme được giữ lại trong các màng, sợi siêu lọc Phương pháp này đã được ứng dụng cố định glucose amylase, glucose isomerase, galactosidase

c Phương pháp hóa học

 Liên kết cộng hóa trị

Cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị với các polymer đã được hoạt hóa, là một trong những phương pháp cố định enzyme phổ biến nhất, đảm bảo liên kết vững chắc của enzyme với vật liệu cố định

polymer

 Enzyme cố định có thể tạo ra bằng hai cách

– Nối đồng hóa trị liên kết các phân tử enzyme riêng biệt lại thành một liên hợp cao phân tử không hòa tan Đây là phương pháp không sử dụng chất mang Các phân tử enzyme sẽ liên kết với nhau qua các cầu nối trung gian để trở thành dạng không hòa tan Các cầu nối trung gian thường dùng là glutaraldehyte

– Kết hợp phân tử enzyme với vật liệu cố định không hòa tan bằng liên kết cộng hóa trị

Điều chế các enzyme cố định loại 1, khi dùng các tác nhân lưỡng chức như bisdiazobenzidin, bisdiazobenzidin, 2,2’ disulfur acid và một số hợp chất khác Đặc biệt người ta thường dùng glutaraldehyte làm tác nhân để đính các phân tử enzyme lại với nhau

Các enzyme cố định loại 2 thường được điều chế phổ biến hơn Chất mang để cố định enzyme phải thỏa mãn những đòi hỏi nhất định sau :

Có độ hòa tan thấp và bền vững đối với các tác động cơ học và hóa học nhất định …

Không gây tác dụng kìm hãm đến enzyme

Không tạo ra hiện tượng hấp thụ không đặc hiệu đối với các protein Vì phản ứng enzyme thường xảy ra trong môi trường nước, nên vật liệu cố định tốt hơn cả là có chất ưa nước

Trị số và dấu điện tích của vật liệu cố định cũng có vai trò nhất định Việc gắn enzyme có hiệu quả hơn cả khi điện tích của enzyme và của vật liệu cố định có dấu ngược nhau Vì lẽ điện tích cùng dấu có thể ngăn cản sự liên kết

Quá trình cố định enzyme có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu vật liệu cố định cố định có chứa các nhóm có khả năng tham gia tương tác trực tiếp với nhóm amin của enzyme Trường hợp ngược lại quá trình xảy ra qua 2 giai đoạn :

 Giai đoạn hoạt hóa vật liệu cố định bằng cách đưa vào các nhóm chức năng có khả năng phản ứng hơn

 Giai đoạn hai giai đoạn kết hợp enzyme

Trường hợp không cần hoạt hóa vật liệu cố định thể hiện rõ trong trường hợp copolymer của maleic alhydric và ethylen Copolymer được dùng phổ biến làm vật liệu cố định để điều chế các dẫn xuất không tan của protease và một số enzyme khác Trường hợp hoạt hóa vật liệu cố định :

 Hoạt hóa chất mang bằng cyanogen halogenur :

Các chất mang có bản chất là polysaccharide ( OH) thường được hoạt hóa sơ bộ bằng cyanogen halogenur Phản ứng hoạt hóa xảy ra trong môi trường kiềm Chất mang hoạt hóa có khả năng liên kết cộng hóa trị với [ NH2] của protein của enzyme

Porath và Bar Eli lần đầu tiên hoạt hóa cellulose, agarose và dextran bằng phương pháp này Quá trình diễn ra như sau:

Khi xử lý polysaccharide bằng BrCN sẽ tạo ra imidocarbonate Carbonate bền vững, còn imidocarbonate tương tác với [ NH2]

NHCOO

OH

OH

OH

OH

 Hoạt hóa bằng ethyl chloroformate :

Khi sử dụng phương pháp hoạt hóa bằng cyanogenbromide, Cyanogenbromide và các sản phẩm trung gian rất độc Chloroformate có thể được sử dụng để tạo ra các sản phẩm trung gian tương tự nhưng không có độc tính Phương pháp được thực hiện như sau :

OH

O O

COO H

 Hoạt hóa bằng carbodiimide

Các chất mang có chứa nhóm carboxyl, có thể được hoạt hóa bằng các dẫn xuất carbodiimide Phản ứng xảy ra trong môi trường acid yếu (pH = 5), nên phương pháp hoạt hóa này phù hợp với các enzyme amylase, pepsin, cellulase …

O

R'

N

C CO

NH O

H

 Hoạt hóa bằng glutaraldehyde

Các chất mang có chứa nhóm NH2 như polyacrylamide,chitin, chitosan, cellulose, tinh bột ghép acrylamide đều có thể sử dụng phương pháp này Glutaraldehyde là chất có chứa hai nhóm aldehyde hoạt hóa Một nhóm sẽ gắn với NH2 của chất mang, nhóm còn lại sẽ gắn vào NH2 của enzyme

CHCHCH

2

2

2 22 22 CCH2 CH2

O

O

CH CHCH

O

NH

 Hoạt hóa bằng 3 aminopropyltriethoxysilane

Hoạt hóa bằng trialkoxysilane cho phép hoạt hóa những vật liệu trơ như thủy tinh có thể gắn với enzyme Thực hiện như sau :

ENZYM

+ ENZYM

O

O

O

O

O

O

+ ENZYM

S

O

O

S

 Hoạt hóa bằng azide

Hiện nay phương pháp này được xem là phương pháp hàng đầu Các chất mang có chứa nhóm chức COOH như CM Cellulose, polyacrylamide và nylon có thể hoạt hóa bằng phương pháp này Trước hết là ester hóa CM Cellulose Sau đó chuyển ester thành hydrazide, rồi azide Azide trong môi trường kiềm sẽ phản ứng [ NH2] của enzyme Phản ứng xảy ra theo sơ đồ :

Glass

OH

NHNHCOCH

ONH

OH

OCH

O OH

OH

ENZYM

OH

O

OH

NCOCH

O

 Hoạt hóa bằng phản ứng diazo

Những chất mang có nhóm amine có thể sử dụng phương pháp này Muối diazo của chất mang hoạt hóa có thể phản ứng không chỉ với nhóm amin mà cả nhóm phenol, imidizol của protein của enzyme Phản ứng cộng hóa trị với enzyme xảy ra nhanh chóng ở nhiệt độ thường và môi trương nước trung bình Quá trình hoạt hóa và gắn enzyme như sau :

OH

NN CH

O HCl

,NaNO

OH

NH CH

+ ENZYM

OH

N CH

 Phương pháp liên kết ion

Dựa trên khả năng tạo liên kết giữa chất mang với enzyme Liên kết ion thường không bền bằng sự hấp thụ giữa enzyme với chất mang

Năm 1956, Mitz là người đầu tiên thực hiện phương pháp liên kết ion để gắn enzyme vào chất mang Ông đã sử dụng DEAE để gắn enzyme vào

Năm 1966, Tosa đã sử dụng DEAE sephadex như một chất mang để gắn aminoacrylase trong qui trình công nghiệp sản xuất amino acid, sau đó là hàng loạt nghiên cứu theo phương pháp này và được áp dụng khá thành công ở qui mô công nghiệp

d Phương pháp khâu mạch (cross linking)

Những hợp chất có hai hoặc đa nhóm chức năng như glutaraldehyde, diisocyanate được dùng làm cầu nối khâu mạch tạo thành đại phân tử không tan trong nước Phương pháp này thường cho hoạt tính thấp là do các hợp chất khâu mạch có thể liên kết vào trung tâm hoạt động của enzyme

Trên đây là một số phương pháp cố định enzyme, sự lựa chon đúng phương pháp thích hợp cho từng enzyme và vật liệu cố định chuyên biệt là một yếu tố tối quan trọng để thu được chế phẩm enzyme cố định có hoạt tính cao Đồng thời cần xác định các điều kiện hoạt động thích hợp cho enzyme cố định Vì vậy để cho quá trình cố định có kết quả nên lưu ý :

Enzyme phải ổn định trong những điều kiện diễn ra phản ứng

Các chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang chủ yếu chỉ tương tác với những nhóm chức năng nằm ngoài trung tâm hoạt động enzyme hoặc tạo liên kết ngang có kích thước lớn không cho phép nó xâm nhập vào trung tâm hoạt động enzyme

Trung tâm hoạt động phải luôn được “bảo vệ” bằng nhiều phương pháp khác nhau như : Enzyme chứa nhóm SH thì cần phải xử lý sơ bộ nó bằng glutathinon hay cystein và chỉ tái hoạt hóa enzyme sau khi đã gắn nó vào vật

liệu cố định hoặc bổ sung vào hỗn hợp phản ứng cơ chất đã được bão hòa bởi enzyme

Cần chọn biện pháp thích hợp để tách “enzyme không được gắn” lên vật liệu cố định, mà không gây ảnh hưởng xấu đến enzyme được gắn

Khi lựa chọn hệ cố định cần để ý đến phản ứng cụ thể và thật vô nghĩa nếu đưa enzyme vào vật liệu cố định mà bản chất vật liệu cố định là polymer bị phân giải bởi enzyme này xúc tác hoặc đặc biệt nếu enzyme bị ức chế bởi sản phẩm của phản ứng tạo ra

2.3.1 Trong công nghiệp

Ngày nay, nhiều qui trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất

Rượu bia : các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng với qui mô lớn

Chế biến sữa : Enzyme lactase cố định để thủy phân lactose trong sữa Năm 1969 Wilson đã sản xuất liên tục glucose bằng glucoamylase cố định Năm 1971 đã dùng chymotrysin liên kết cộng hóa trị với carboximethyl cellulase làm đông tụ sữa thay cho renin đắt tiền

 Thu nhận hỗn hợp glucose fructose

Năm 1973 hãng Clinton Corn (Mỹ) đưa vào sản xuất công nghiệp glucoisomerase chuyển hóa glucose thành fructose với tỉ lệ 1:1, thông thường được gắn với các polymer vô cơ qua các liên kết đồng hóa trị

 Tách hỗn hợp aminoacid nhờ aminocylase

Công trình được sử dụng đầu tiên ở Nhật Bản để sản xuất methionine Hãng Snam Progetti (Ý) nhốt aminoacid trong sợi cellulose triacetat

Hãng Tanaka Cuaky (Nhật) sử dụng phương pháp hấp thụ aminoacid trên DEAE Cellulose