Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm phytophthora SP gây bệnh trên cây có múi ( luận văn thạc sĩ chuyên ngành công nghệ sinh học)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ DIỆU HƯƠNG SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA SP GÂY BỆNH TRÊN CÂY CĨ MÚI Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 8420201 Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Hồng Hiển TS Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 24 tháng 09 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Diệu Hương i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, em nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép em bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Hồng Hiển TS Nguyễn Xuân Cảnh tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho em suốt trình học tập thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ em trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh, toàn thể anh, chị, bạn bè em thực tập nghiên cứu phịng thí nghiệm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp Và cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vô hạn, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ người thân em nuôi nấng, động viên tạo động lực cho em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 24 tháng 09 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Diệu Hương ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn x Thesis abstract xii Phần Mở đầu 1.1 Mục đích nghiên cứu đề tài 1.2 Yêu cầu đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tổng quan tình hình sản xuất tiêu thụ có múi 2.1.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi giới 2.1.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi Việt Nam 2.2 Sâu bệnh hại có múi 2.3 Giới thiệu nấm Phytophthora gây bệnh có múi 2.3.1 Nấm Phytophthora 2.3.2 Cơ chế gây bệnh 11 2.3.3 Biện pháp phòng trừ 12 2.3.4 Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật 13 2.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ngồi nước 15 2.4.1 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài nước 15 2.4.2 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài nước 17 Phần Nội dung phương pháp nghiên cứu 19 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.2 Vật liệu 19 3.3 Môi trường nghiên cứu 19 3.4 Dụng cụ, thiết bị hóa chất sử dụng 20 3.4.1 Dụng cụ 20 iii 3.4.2 Thiết bị 20 3.4.3 Hoá chất 20 3.5 Phương pháp nghiên cứu 20 3.5.1 Giữ giống vi sinh vật 20 3.5.2 Phương pháp phân lập mẫu nấm bệnh 20 3.5.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng nấm 22 3.5.4 Phương pháp tái lây nhiễm 23 3.5.5 Đánh giá dặc điểm sinh học 23 3.5.6 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh chủng vi sinh vật 24 3.5.7 Khảo sát số đặc điểm hình thái sinh học chủng vi sinh vật 25 3.5.8 Định danh chủng nấm bệnh, xạ khuẩn, vi khuẩn 27 Phần Kết thảo luận 31 4.1 Phân lập xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh có múi 31 4.1.1 Phân lập 31 4.1.2 Lây nhiễm nhân tạo 33 4.1.3 Đặc điểm hình thái 34 4.1.4 Một số đặc điểm sinh học chủng HDB DB5 35 4.1.5 Định danh chủng nấm DB5 37 4.2 Sàng lọc nghiên cứu số đặc điểm sinh học số chủng vi sinh vật có khả đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh có múi 39 4.2.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả đối kháng 39 4.2.2 Một số đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn 38 40 4.2.3 Định danh chủng xạ khuẩn 38 43 4.2.4 Một số đặc điểm sinh học phân loại hai chủng vi khuẩn VK1 VK2 45 4.2.5 Định danh chủng vi khuẩn VK1 VK2 48 4.4 Thảo luận 50 4.4.1 Kết phân lập xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh 51 4.4.2 Kết sàng lọc nghiên cứu số đặc điểm sinh học số chủng vi sinh vật có khả đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh có múi 52 iv Phần Kết luận kiến nghị 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Kiến nghị 54 Tài liệu tham khảo 55 Phụ lục 58 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt µl Microliter µM Micromol CMC Carboxylmethyl cellulose CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide ĐC Đối chứng DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid EtBr Ethidium bromide FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FCOJ Frozen Concentrate Orange Juice LB Luria Bertani ml Mililiter mm Milimeter nm Nanometer NN&PTNT Nông nghiệp Phát triển nông thôn PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato D-glucose agar RNA Ribonucleic acid rRNA RNA ribosome sp Species TAE Tris-Acetic-EDTA WA Water agar vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Một số đặc điểm hình thái chủng nấm phân lập 32 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Một số bệnh điển hình có múi nấm Phytophthora gây Hình 2.2 Hình thái nấm Phytophthora Hình 2.3 Chu kì sống Phytophthora Hình 4.1 Một số dấu hiệu bệnh thu mẫu (A) rễ; (B) (C) (D) thân; (E) (F) (G) lá; (H) 31 Hình 4.2 Phân lập phương pháp bẫy cánh hoa hồng 31 Hình 4.3 Tái lây nhiễm chanh sau tuần 34 Hình 4.4 Đặc điểm hình thái chủng nấm HDB DB5 quan sát qua kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần 34 Hình 4.5 Khả sinh enzyme cellulase chủng nấm HDB DB5 36 Hình 4.6 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy đến sinh trưởng chủng nấm HDB DB5 sau ngày nuôi 37 Hình 4.7 Cây phân loại chủng DB5 xây dựng phần mềm MEGA7 38 Hình 4.8 Hoạt tính đối kháng số chủng vi khuẩn xạ khuẩn với chủng nấm bệnh HDB DB5 môi trường PGA sau ngày ni cấy 39 Hình 4.9 Quan sát hình thái chủng xạ khuẩn 38 40 Hình 4.10 Ảnh hưởng nồng độ muối đến sinh trưởng, phát triển chủng xạ khuẩn 38 sau ngày nuôi cấy 41 Hình 4.11 Khả sinh sắc tố Melanin chủng xạ khuẩn 38 môi trường ISP6 37oC sau ngày nuôi cấy 42 Hình 4.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 38 môi trường Gause-I sau ngày ni cấy 43 Hình 4.13 Cây phân loại chủng 38 xây dựng phần mềm MEGA7 44 Hình 4.14 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn VK1 VK2 môi trường LB 30oC sau ngày nuôi cấy 45 Hình 4.15 Khả di động hai chủng vi khuẩn VK1 VK2 nuôi cấy môi trường LB 30°C sau ngày nuôi 46 Hình 4.16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn VK1 môi trường LB sau ngày nuôi cấy 47 viii Hình 4.17 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn VK2 môi trường LB sau ngày nuôi cấy 47 Hình 4.18 Cây phân loại chủng VK1 xây dựng phần mềm MEGA7 49 Hình 4.19 Cây phân loại chủng VK2 xây dựng phần mềm MEGA7 50 ix ... sp gây bệnh có múi? ?? 1.1 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Sàng lọc định danh số chủng vi sinh vật đối kháng với nấm Phytophthora sp gây bệnh có múi 1.2 YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI Phân lập số chủng nấm Phytophthora. .. chủng vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh Định danh số chủng nấm bệnh số chủng vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh có múi PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU... Phytophthora sp gây bệnh 51 4.4.2 Kết sàng lọc nghiên cứu số đặc điểm sinh học số chủng vi sinh vật có khả đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh có múi 52 iv Phần Kết luận kiến nghị